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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段连接问题
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 长片段连接问题 已有8人参与

最近做的回收产物都连不上,所以双酶切后的产物是直接纯化后连接的,基因三千多,载体六千多,连了好久都没连上,转化后的菌斑菌P都是假的.哪位知道怎么回事啊?
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1楼 2012-08-13 10:04:30
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ankang0910

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我去，我和楼主遭遇一样，连片段大小都一样！！！我也连不上！！
敢问乙醇沉淀肿么个做法？？？？
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实验顺利！！
3楼2012-08-13 10:55:13
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-14 13:50:52
我之前连接的片段都比你的大，载体也差不多。较大目的片段往载体上连接有一定的困难，对那些只切掉几十个碱基的载体可以不采取切胶回收的方法，而是用乙醇沉淀法回收载体，此方法使目的片段较易连接到载体上。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
2楼2012-08-13 10:45:47
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ankang0910 at 2012-08-13 10:55:13
我去，我和楼主遭遇一样，连片段大小都一样！！！我也连不上！！
敢问乙醇沉淀肿么个做法？？？？

乙醇沉淀法:产物加2.5倍体积100%酒精（预冷）和1/10倍体积3 M 醋酸钠(pH=5.2,)。-80沉淀30分钟，4度12000rpm离心10 min，再用75%和100%酒精各洗一次就可以了。
不过生工都有纯化试剂盒，10分钟就解决了
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4楼2012-08-13 11:54:02
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2012-08-13 10:45:47
我之前连接的片段都比你的大，载体也差不多。较大目的片段往载体上连接有一定的困难，对那些只切掉几十个碱基的载体可以不采取切胶回收的方法，而是用乙醇沉淀法回收载体，此方法使目的片段较易连接到载体上。

我也没有加收过，PCR产物及双酶切产物都是直接纯化后做的，但也是连不上。请问你最后是怎么连上的啊
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5楼2012-08-13 11:55:21
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