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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手用试剂盒提取植物RNA时的一些小问题
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 新手用试剂盒提取植物RNA时的一些小问题

这两天刚开始接触植物RNA提取，用的试剂盒，有些小问题不是很清楚，看看大家都是怎么处理的。
1.液氮研磨样品到什么程度？
我磨到细粉发白，中途加了5-6次液氮，每次5-6ml，很快就挥发了，基本上一直都在磨。
2.如何把样品移到离心管中？
离心管用液氮遇冷过，小勺也遇冷过，但是舀到离心管时，发现小勺进不去，不方便把细粉送进离心管，很多粘在了管口或者离心管接近管口的壁上。
3.如何界定移入的量不超过100mg？
100mg的细粉，大概有多少？我用2ml 离心管，高度大概5mm，不知道量合适不？
4.加入裂解液后涡旋，然后再加入0.5倍体积乙醇，在涡旋，有技术窍门吗？
都涡旋，还是手拿着来回摇摇就可以了。
5.匀浆移入吸附柱后会否堵住柱子？
这个问题与界定样品的量有关系，离心之后把吸附柱上都是材料残渣，会不会有影响？
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1楼 2012-08-01 22:28:51
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
beescity(金币+1): 谢谢参与
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2楼2012-08-01 22:55:46
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zxd95

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
beescity(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 真是热心的虫虫啊 2012-08-02 15:31:54
1.液氮研磨样品到什么程度？
充分研磨，呈均匀粉状即可；
2.如何把样品移到离心管中？
直接加TriZOL，研磨均匀后，再倒入管中；或用1 ml移液枪转移。
3.如何界定移入的量不超过100mg？
取样时，可以用电子天平秤。
4.加入裂解液后涡旋，然后再加入0.5倍体积乙醇，在涡旋，有技术窍门吗？
使用振荡器即可，最短15s。
5.匀浆移入吸附柱后会否堵住柱子？
可以离心后，取上清上柱。
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4楼2012-08-01 23:12:30
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beescity

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zxd95 at 2012-08-01 23:12:30
1.液氮研磨样品到什么程度？
充分研磨，呈均匀粉状即可；
2.如何把样品移到离心管中？
直接加TriZOL，研磨均匀后，再倒入管中；或用1 ml移液枪转移。
3.如何界定移入的量不超过100mg？
取样时，可以用电子天平 ...

对于样品取样时称重，我忘记说了，样品不是在实验室培养的，是在大自然当中生长的，取样时貌似不具备称重条件。
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5楼2012-08-02 00:24:27
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wyg888

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
beescity(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:32:22
RNA提取原理：
     通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：
破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、 洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、 融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于- 70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。
氯化锂法提取总RNA：
       本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丢失的缺陷。
试验试剂：
1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】
2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
试验步骤：
1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。
2、 匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。
3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。
4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。
5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。
6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。
蛋白酶－热酚法－本方法适合于病毒RNA的提取
试验试剂：
1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml）
2、 2×缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL
试验步骤：
1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。
2、 加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。
3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。
4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。
5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。
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9楼2012-08-02 08:43:27
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
beescity(金币+1): 谢谢参与
充分研磨，呈均匀粉状即可
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16楼2012-08-02 09:58:38
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
beescity(金币+1): 谢谢参与
直接加TriZOL，研磨均匀后，再倒入管中，或用1ml移液枪转移。
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17楼2012-08-02 09:59:14
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
★
beescity(金币+1): 谢谢参与
跟着来学习一下~~
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18楼2012-08-02 09:59:55
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beescity

至尊木虫 (著名写手)
OD260/OD230只有1.880，存在异硫氰酸胍或者β-巯基乙醇，是不是应该减少一点点裂解液的量啊？说明后面的wash buffer 不能洗干净。
求高手解答！
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19楼2012-08-03 21:02:34
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youdao1

铁虫 (知名作家)
★
beescity(金币+1): 谢谢参与
祝福楼主
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7楼2012-08-02 08:06:39
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12101008

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最近提RNA也是遇到诸多问题，不过好像提取的环境人要少，要戴口罩，还尽量不说话好。
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20楼2012-11-23 23:19:11
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dingcong1216

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by zxd95 at 2012-08-01 23:12:30
1.液氮研磨样品到什么程度？
充分研磨，呈均匀粉状即可；
2.如何把样品移到离心管中？
直接加TriZOL，研磨均匀后，再倒入管中；或用1 ml移液枪转移。
3.如何界定移入的量不超过100mg？
取样时，可以用电子天平 ...

我想问一下，加Trizol后凝固了该怎么办？对RNA有没有什么影响？之前做的时候都没有凝固，最近几次都出现这种情况。由于我的是微藻，量很少，不能将研磨后的样品转入离心管中再只能加Trzol。
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21楼2013-10-14 15:50:29
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beescity

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by dingcong1216 at 2013-10-14 15:50:29
我想问一下，加Trizol后凝固了该怎么办？对RNA有没有什么影响？之前做的时候都没有凝固，最近几次都出现这种情况。由于我的是微藻，量很少，不能将研磨后的样品转入离心管中再只能加Trzol。...

我想可能是水的原因吧。没做过这类材料。
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22楼2013-10-14 19:28:38
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neu2343楼
2012-08-01 23:08   回复  
beescity(金币+1): 谢谢参与
goingabroad6楼
2012-08-02 02:55   回复  
beescity(金币+1): 谢谢参与
小花8218楼
2012-08-02 08:32   回复  
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郑克宁10楼
2012-08-02 08:44   回复  
beescity(金币+1): 谢谢参与
jh838111楼
2012-08-02 09:00   回复  
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假大空12楼
2012-08-02 09:16   回复  
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假大空13楼
2012-08-02 09:17   回复  
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祝福。帮
wangyanbo14楼
2012-08-02 09:26   回复  
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wangyanbo15楼
2012-08-02 09:27   回复  
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