| 查看: 2918 | 回复: 21 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
新手用试剂盒提取植物RNA时的一些小问题
|
|||
|
这两天刚开始接触植物RNA提取，用的试剂盒，有些小问题不是很清楚，看看大家都是怎么处理的。 1.液氮研磨样品到什么程度？ 我磨到细粉发白，中途加了5-6次液氮，每次5-6ml，很快就挥发了，基本上一直都在磨。 2.如何把样品移到离心管中？ 离心管用液氮遇冷过，小勺也遇冷过，但是舀到离心管时，发现小勺进不去，不方便把细粉送进离心管，很多粘在了管口或者离心管接近管口的壁上。 3.如何界定移入的量不超过100mg？ 100mg的细粉，大概有多少？我用2ml 离心管，高度大概5mm，不知道量合适不？ 4.加入裂解液后涡旋，然后再加入0.5倍体积乙醇，在涡旋，有技术窍门吗？ 都涡旋，还是手拿着来回摇摇就可以了。 5.匀浆移入吸附柱后会否堵住柱子？ 这个问题与界定样品的量有关系，离心之后把吸附柱上都是材料残渣，会不会有影响？ |
回复此楼» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有272人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有2人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 提取RNA的试剂盒哪家的好？
已经有15人回复
- 植物RNA的提取
已经有22人回复
- SDS-LiCl提取植物RNA
已经有15人回复
- 提取RNA与做RT-PCR的问题
已经有26人回复
- 植物RNA提取后电泳检测
已经有16人回复
- RNA 提取的一些问题，请大家帮忙回答
已经有13人回复
- 新手提RNA，请教几个问题
已经有8人回复
- 关于RNA提取的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】求助高手-棉花中RNA提取质量验证及反转后cDNA质量验证问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】试剂盒提不出RNA，求救啊
已经有39人回复
- 【求助/交流】植物组织RNA提取求高人指点
已经有6人回复
- 【求助/交流】想问问天根植物总RNA提取试剂盒的使用
已经有9人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
重庆大学刘坤教授课题组招聘等离子体农业应用相关方向科研助理（农学、等离子体、电子
+1/85
-
山东大学杨再兴课题组长期诚聘博士后
+2/46
-
哈尔滨医科大学生物医学工程相关专业招收调剂硕士生
+1/37
-
哈尔滨理工大学0805材料科学与工程、0856材料与化工、0703化学，接收调剂
+1/36
-
招收调剂生（一志愿07开头专业），海洋生物专业4个名额
+1/36
-
山东航空学院安全工程专业085702第三轮接收研究生调剂，欢迎咨询
+1/36
-
武汉工程大学环境生态与生物工程学院资源生物技术团队师资博士后招聘启事
+1/21
-
大连海洋大学资源与环境专硕（0857）接收调剂学生
+1/19
-
吉林大学电合成与组装方向
+1/18
-
沈阳工业大学石油化工学院传质强化研究团队招收硕士研究生调剂
+1/16
-
粤港澳大湾区量子中心与南方科技大学联合招收2026级博士生（材料、凝聚态物理方向）
+1/16
-
昆明理工大学化学工程学院张恒、高欣老师课题组调剂招生，还有名额
+1/13
-
AIRS微纳机器人中心诚招研究型硕士生（Mphil）、全职科研助理（RA）、实习生（Intern�
+1/11
-
华南理工大学招收2026申请考核制博士生1名（物理材料微电子等方向）
+1/4
-
福建理工大学学硕08开头还有调剂名额
+1/3
-
贵州师大山地实验室学硕调剂名额，急需调剂
+1/3
-
上海市过程安全与智能控制重点实验室招收安全工程研究生调剂-上岸既是高质量就业！
+1/2
-
人工智能与计算化学交叉研究方向 接受调剂
+1/2
-
多色流式Panel如何实现精准免疫分型？
+1/2
-
招收0703开头的学硕调剂生 线上复试
+1/1
5楼2012-08-02 00:24:27
2楼2012-08-01 22:55:46
4楼2012-08-01 23:12:30
★ ★ ★
beescity(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:32:22
beescity(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-02 15:32:22
|
RNA提取原理： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 RNA提取的一般步骤 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。 第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 实验步骤： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。 1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。 3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。 4、 洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。 5、 融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于- 70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。 氯化锂法提取总RNA： 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丢失的缺陷。 试验试剂： 1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】 2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 试验步骤： 1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。 2、 匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。 3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。 4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。 5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。 6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。 蛋白酶－热酚法－本方法适合于病毒RNA的提取 试验试剂： 1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml） 2、 2×缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL 试验步骤： 1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。 2、 加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。 3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。 4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。 5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。 |
9楼2012-08-02 08:43:27
简单回复
jh838111楼
2012-08-02 09:00
回复
beescity(金币+1): 谢谢参与
假大空13楼
2012-08-02 09:17
回复
beescity(金币+1): 谢谢参与
祝福。帮
