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新手用试剂盒提取植物RNA时的一些小问题
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这两天刚开始接触植物RNA提取，用的试剂盒，有些小问题不是很清楚，看看大家都是怎么处理的。 1.液氮研磨样品到什么程度？ 我磨到细粉发白，中途加了5-6次液氮，每次5-6ml，很快就挥发了，基本上一直都在磨。 2.如何把样品移到离心管中？ 离心管用液氮遇冷过，小勺也遇冷过，但是舀到离心管时，发现小勺进不去，不方便把细粉送进离心管，很多粘在了管口或者离心管接近管口的壁上。 3.如何界定移入的量不超过100mg？ 100mg的细粉，大概有多少？我用2ml 离心管，高度大概5mm，不知道量合适不？ 4.加入裂解液后涡旋，然后再加入0.5倍体积乙醇，在涡旋，有技术窍门吗？ 都涡旋，还是手拿着来回摇摇就可以了。 5.匀浆移入吸附柱后会否堵住柱子？ 这个问题与界定样品的量有关系，离心之后把吸附柱上都是材料残渣，会不会有影响？ |
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5楼2012-08-02 00:24:27
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RNA提取原理： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 RNA提取的一般步骤 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。 第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 实验步骤： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。 1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。 3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。 4、 洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。 5、 融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于- 70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。 氯化锂法提取总RNA： 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丢失的缺陷。 试验试剂： 1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】 2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 试验步骤： 1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。 2、 匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。 3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。 4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。 5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。 6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。 蛋白酶－热酚法－本方法适合于病毒RNA的提取 试验试剂： 1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml） 2、 2×缓冲液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL 试验步骤： 1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。 2、 加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。 3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。 4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。 5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。 6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。 |
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