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stewart3261

铜虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR相关问题

大神帮我!
目前在做心脏组织的逆转录PCR。遇到的问题,首先用trizol提取总RNA,测其吸光度比值260/280在1.5左右,远大不到1.8-2.0。有人说是因为我用DEC水稀释做空白,用TE会好些,暂时还没有实践。比值小于1.8应该是有蛋白污染吧?然后如果继续做下面的逆转录和扩增有什么影响呢?
    扩增时问题,内参表达不好(内参为gapdh)。并且阴性对照管也有表达!?ct值在25到28左右!这个问题是不是很严重?
    大神指导一下吧!
用的枪头,EP管都是直接购买的无酶的产品,有一段时间了。会不会应经被污染有RNA酶呢?
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-19 15:15:36
电泳和测定OD值是两个不同但有些重合的评价RNA的方法,测定OD值主要看有无杂质污染,跑胶主要看完整性并确定有否基因组或蛋白污染,所以个人觉得电泳是比较靠谱的方法,如果电泳条带很漂亮的话,RNA一般不会有问题的,多试试吧,实验顺利
9楼2012-07-19 11:31:17
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-19 15:15:11
RNA能不能用主要看电泳,有没有降解。OD值看的是纯度,不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右,得确定是不是扩增产物,还是引物二聚体?可以跑下电泳。
如果是产物的话,那就是污染了。
2楼2012-07-18 19:09:40
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-18 19:09:40
RNA能不能用主要看电泳,有没有降解。OD值看的是纯度,不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右,得确定是不是扩增产物,还是引物二聚体?可以跑下电泳。
如果是产物的话,那就是污染了。

就是说,纯度不够会影响后面的扩增?
3楼2012-07-18 22:36:13
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-19 15:15:22
做荧光定量的pcr必须保证rna的完整性,提取rna时,所有的注意事项,都必须小心处理。不能图省事。提取rna用的所有东西,最好用depc水处理。祝你好运。
coasttocoast。
4楼2012-07-18 22:37:09
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