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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR相关问题
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR相关问题

大神帮我！
目前在做心脏组织的逆转录PCR。遇到的问题，首先用trizol提取总RNA，测其吸光度比值260/280在1.5左右，远大不到1.8-2.0。有人说是因为我用DEC水稀释做空白，用TE会好些，暂时还没有实践。比值小于1.8应该是有蛋白污染吧？然后如果继续做下面的逆转录和扩增有什么影响呢？
    扩增时问题，内参表达不好（内参为gapdh）。并且阴性对照管也有表达！？ct值在25到28左右！这个问题是不是很严重？
    大神指导一下吧！
用的枪头，EP管都是直接购买的无酶的产品，有一段时间了。会不会应经被污染有RNA酶呢？
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1楼 2012-07-18 15:32:09
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-18 19:09:40
RNA能不能用主要看电泳，有没有降解。OD值看的是纯度，不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右，得确定是不是扩增产物，还是引物二聚体？可以跑下电泳。
如果是产物的话，那就是污染了。

就是说，纯度不够会影响后面的扩增？
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3楼2012-07-18 22:36:13
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 22:37:09
做荧光定量的pcr必须保证rna的完整性，提取rna时，所有的注意事项，都必须小心处理。不能图省事。提取rna用的所有东西，最好用depc水处理。祝你好运。

RNA的完整性只能通过电泳来检查吗？我们用的枪头和EP管都是无酶的也要用DEPC水处理吗？
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5楼2012-07-18 22:39:46
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 23:23:50
rna的完整性一般使用电泳检测，还有用甲醛变性电泳方法检测的，一般没有必要，你们买的东西不用再处理了。...

谢谢。我们都没有做过电泳检测其完整性，一般都是看一下纯度，然后直接做后面的了。其两波长吸光度比值偏小与稀释的溶液有关吗？谢谢
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7楼2012-07-19 08:23:05
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-19 11:31:17
电泳和测定OD值是两个不同但有些重合的评价RNA的方法，测定OD值主要看有无杂质污染，跑胶主要看完整性并确定有否基因组或蛋白污染，所以个人觉得电泳是比较靠谱的方法，如果电泳条带很漂亮的话，RNA一般不会有问题的 ...

谢谢了。不过关于RNA跑胶这方面我还没有接触过。看来要补的知识还很多啊！谢谢了……
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10楼2012-07-19 15:27:35
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-19 15:39:23
就上个样，很简单，小木虫里帖子挺多

谢谢！我正在找呢！十分感谢。
RNA的吸光度比值偏小跟稀释溶剂有关吗？我看到有说用TE稀释在测定时比值会比较大
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13楼2012-07-19 15:57:42
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by @xiaowanzi at 2012-07-19 15:56:17
提取组织mRNA的话，用试剂盒效果会好，我就是用试剂盒提的，A260/A280可以达到1.8。

谢谢啊。麻烦问一下，你用的是什么试剂盒，哪个公司的？
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15楼2012-07-21 09:40:55
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by wfli.bees at 2012-07-21 14:40:04
RNA OD 260/280 1.5说明提取物不纯，蛋白残留严重，至于是用DEPC 水稀释还是TE稀释，我认为并不重要，我是用前者稀释的，完全没有问题。阴性对照ct值在25到28左右，我想比较大的可能是发生污染，这可以从融解曲线出 ...

谢谢帮助！我今天又提了一次RNA，然后用没有稀释的DEPC水直接溶解RNA，然后分别取10ul稀释到2ml的DEPC和TE中测吸光度，结果有明显的不同。TE的在2左右，而DEPC远达不到1.8。
你好，我想问一下那个阴性对照的扩增是由于什么污染引起的呢？是引物还是试剂呢？
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17楼2012-07-22 15:44:06
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