应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR相关问题
171/2返回列表12下一页
查看: 1886  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

stewart3261

铜虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR相关问题

大神帮我！
目前在做心脏组织的逆转录PCR。遇到的问题，首先用trizol提取总RNA，测其吸光度比值260/280在1.5左右，远大不到1.8-2.0。有人说是因为我用DEC水稀释做空白，用TE会好些，暂时还没有实践。比值小于1.8应该是有蛋白污染吧？然后如果继续做下面的逆转录和扩增有什么影响呢？
    扩增时问题，内参表达不好（内参为gapdh）。并且阴性对照管也有表达！？ct值在25到28左右！这个问题是不是很严重？
    大神指导一下吧！
用的枪头，EP管都是直接购买的无酶的产品，有一段时间了。会不会应经被污染有RNA酶呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-07-18 15:32:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-19 15:15:11
RNA能不能用主要看电泳，有没有降解。OD值看的是纯度，不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右，得确定是不是扩增产物，还是引物二聚体？可以跑下电泳。
如果是产物的话，那就是污染了。
赞一下 回复此楼
2楼2012-07-18 19:09:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-18 19:09:40
RNA能不能用主要看电泳，有没有降解。OD值看的是纯度，不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右，得确定是不是扩增产物，还是引物二聚体？可以跑下电泳。
如果是产物的话，那就是污染了。

就是说，纯度不够会影响后面的扩增？
赞一下 回复此楼
3楼2012-07-18 22:36:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-19 15:15:22
做荧光定量的pcr必须保证rna的完整性，提取rna时，所有的注意事项，都必须小心处理。不能图省事。提取rna用的所有东西，最好用depc水处理。祝你好运。
赞一下 回复此楼
coasttocoast。
4楼2012-07-18 22:37:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 22:37:09
做荧光定量的pcr必须保证rna的完整性，提取rna时，所有的注意事项，都必须小心处理。不能图省事。提取rna用的所有东西，最好用depc水处理。祝你好运。

RNA的完整性只能通过电泳来检查吗？我们用的枪头和EP管都是无酶的也要用DEPC水处理吗？
赞一下 回复此楼
5楼2012-07-18 22:39:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-07-18 22:39:46
RNA的完整性只能通过电泳来检查吗？我们用的枪头和EP管都是无酶的也要用DEPC水处理吗？...

rna的完整性一般使用电泳检测，还有用甲醛变性电泳方法检测的，一般没有必要，你们买的东西不用再处理了。
赞一下 回复此楼
coasttocoast。
6楼2012-07-18 23:23:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 23:23:50
rna的完整性一般使用电泳检测，还有用甲醛变性电泳方法检测的，一般没有必要，你们买的东西不用再处理了。...

谢谢。我们都没有做过电泳检测其完整性，一般都是看一下纯度，然后直接做后面的了。其两波长吸光度比值偏小与稀释的溶液有关吗？谢谢
赞一下 回复此楼
7楼2012-07-19 08:23:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-07-18 22:36:13
就是说，纯度不够会影响后面的扩增？...

如果你的杂质里面含有抑制PCR扩增的东西，比如一些次生代谢物，就会对后面的步骤有影响。
赞一下 回复此楼
8楼2012-07-19 11:03:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-19 15:15:36
电泳和测定OD值是两个不同但有些重合的评价RNA的方法，测定OD值主要看有无杂质污染，跑胶主要看完整性并确定有否基因组或蛋白污染，所以个人觉得电泳是比较靠谱的方法，如果电泳条带很漂亮的话，RNA一般不会有问题的，多试试吧，实验顺利
赞一下 回复此楼
9楼2012-07-19 11:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-19 11:31:17
电泳和测定OD值是两个不同但有些重合的评价RNA的方法，测定OD值主要看有无杂质污染，跑胶主要看完整性并确定有否基因组或蛋白污染，所以个人觉得电泳是比较靠谱的方法，如果电泳条带很漂亮的话，RNA一般不会有问题的 ...

谢谢了。不过关于RNA跑胶这方面我还没有接触过。看来要补的知识还很多啊！谢谢了……
赞一下 回复此楼
10楼2012-07-19 15:27:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 stewart3261 的主题更新
171/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 伙伴们，祝我生日快乐吧 +17 myrtle 2026-03-10 26/1300 2026-03-16 18:32 by 青橙Ln
[考研] 333求调剂 +3 文思客 2026-03-16 7/350 2026-03-16 18:21 by 文思客
[考研] 070300化学学硕求调剂 +6 太想进步了0608 2026-03-16 6/300 2026-03-16 16:13 by kykm678
[考研] 344求调剂 +3 knight344 2026-03-16 3/150 2026-03-16 09:42 by 无际的草原
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +5 薛云鹏 2026-03-15 5/250 2026-03-15 20:38 by Logic2024
[考研] 080500，材料学硕302分求调剂学校 +4 初识可乐 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:08 by peike
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-10 11/550 2026-03-14 12:18 by 邱gl
[考研] 311求调剂 +5 牛乳糖的卡卡 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:05 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 337一志愿华南理工0805材料求调剂 +7 mysdl 2026-03-11 9/450 2026-03-13 22:43 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] 工科，求调剂 +3 我887 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:39 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:41 by JourneyLucky
[考研] 【考研调剂求收留】 +3 Ceciilia 2026-03-11 3/150 2026-03-13 20:18 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:30 by 求调剂zz
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
[考研] 268求调剂 +4 好运连绵不绝 2026-03-12 4/200 2026-03-13 10:45 by hyswxzs
[考研] 070303一志愿西北大学学硕310找调剂 +3 d如愿上岸 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:43 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭