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wy135033405

木虫 (小有名气)

[求助] 无模板pcr合成短片段 一直失败

在下需要合成的片段为107bp,为了节省开支,设计了6条短引物,以数字大致表示如下(一条链的5' 端为起点,互补链也从该方向计数,加' 表示):

p1: 1-30  p2:15'-45'  p3: 31-60 p4: 46'-75'  p5: 60-90 p6: 76'-107'

如图

6条引物去除重叠部分可以拼凑成目的片段,目前使用多种酶、体系、反应条件均无法p出目的片段,在不重新设计引物的条件下,请大家提供些意见。本帖只为求助,如果确实通过您的方案做出结果,另赠100金币,绝不食言。

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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流解答问题 2012-07-19 15:22:08
这个我做过,当时更长,引物差不多有80-90bp左右的引物,一次次的加长,其实也很简单。你的引物这么短,应该更好做点。首先将1、2、3加进去,你调整一下浓度,大概的比例是1、2、3递增。然后割胶回收,同样的方法就能得到更长的片段。
最简单的办法就是一次一次加长,首先将12退火延伸,以其产物为模板,以1、3为引物,以次类推,得到107bp片段。
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
31楼2012-07-19 12:12:06
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 14:58:04
多谢~我自己设计过先用34退火,然后加25退火延伸,再加16,似乎不成,在体系和条件上有什么要注意的么?...

不会呀,你确定实现将34退火延伸,产物纯化或割胶为模板后以25为引物做一个完整的PCR,循环30次,后面同前,没有结果么?
另外,你第一步的产物确定没问题么?
我以前就这样搞得,没问题呀。
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
35楼2012-07-19 19:27:20
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