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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】以DNA为模板做PCR这么难！
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nnsulei

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】以DNA为模板做PCR这么难！已有9人参与

小弟通过RACE获得了CDNA全长，想分析其在基因组水平的内含子，但是以DNA为模板怎么都P不出来。郁闷啊。延伸时间都达到7分钟了还没有，DNA提的感觉也可以了，请高人指点!
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努力做就有结果～
1楼2011-04-10 12:46:58
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nnsulei

金虫 (正式写手)
凡是能提供有效帮助的，本人必追加悬赏！！！
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努力做就有结果～
2楼2011-04-10 12:48:25
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-04-10 19:08:25
引用回帖:
Originally posted by nnsulei at 2011-04-10 12:46:58:
小弟通过RACE获得了CDNA全长，想分析其在基因组水平的内含子，但是以DNA为模板怎么都P不出来。郁闷啊。延伸时间都达到7分钟了还没有，DNA提的感觉也可以了，请高人指点!

延伸时间长了并不总是有效果。不知lz是否了解整个基因的长度？

以前我扩增6k的片段，用LA taq，4min以内的延伸时间就足够了。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2011-04-10 13:10:19
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nnsulei

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-10 13:10:19:
延伸时间长了并不总是有效果。不知lz是否了解整个基因的长度？

以前我扩增6k的片段，用LA taq，4min以内的延伸时间就足够了。

我的基因在其他物种里含内含子一般就5，6KB，我延伸时间逐渐加长的，就是没结果。
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努力做就有结果～
4楼2011-04-10 15:09:55
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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amisking(金币+1, EPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-04-10 19:08:37
引用回帖:
Originally posted by nnsulei at 2011-04-10 15:09:55:
我的基因在其他物种里含内含子一般就5，6KB，我延伸时间逐渐加长的，就是没结果。

用LA taq扩增4min以内足够了。以前有个师兄的经验，他的片段也很大，延伸时间快10min了还扩不出来，最后发现不是延伸时间的原因。

以前也遇见过PCR总是阴性的情况，虽然没找到原因，但把所有的PCR成分更换以后就可以了。不知lz PCR有没有加相应的对照？

[ Last edited by zhaohq1209 on 2011-4-10 at 15:51 ]
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
5楼2011-04-10 15:49:59
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)
★
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很好扩啊,我CDNA5'费老劲了
DNA全长一下就扩出来了
用了两对引物都扩出来了
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6楼2011-04-10 15:54:56
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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把退火温度降低5℃试试吧。
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7楼2011-04-10 16:55:54
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
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可能是引物不合适，没有特异性
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风雪夜归人
8楼2011-04-11 12:50:43
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td0605

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励交流实践经验 2011-04-11 16:07:58
我之前扩基因组时，模板加多了，扩出来很多杂带，几乎是一片弥散，后来减小了模板量，稍稍提高了退火温度，还是扩出来4条带，汗！心一横，全部回收了测序，还好，其中一条就是我需要的。
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9楼2011-04-11 15:13:16
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charchy

铁虫 (小有名气)
★
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我也有出现过从DNA扩增片段失败的，会不会是你的片段GC含量太高了，你换GC buffer试一下
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10楼2011-04-11 20:50:11
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