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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流解答问题 2012-07-19 15:22:08
这个我做过,当时更长,引物差不多有80-90bp左右的引物,一次次的加长,其实也很简单。你的引物这么短,应该更好做点。首先将1、2、3加进去,你调整一下浓度,大概的比例是1、2、3递增。然后割胶回收,同样的方法就能得到更长的片段。
最简单的办法就是一次一次加长,首先将12退火延伸,以其产物为模板,以1、3为引物,以次类推,得到107bp片段。
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
31楼2012-07-19 12:12:06
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wy135033405

木虫 (小有名气)

引用回帖:
31楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2012-07-19 12:12:06
这个我做过,当时更长,引物差不多有80-90bp左右的引物,一次次的加长,其实也很简单。你的引物这么短,应该更好做点。首先将1、2、3加进去,你调整一下浓度,大概的比例是1、2、3递增。然后割胶回收,同样的方法就 ...

多谢~我自己设计过先用34退火,然后加25退火延伸,再加16,似乎不成,在体系和条件上有什么要注意的么?
32楼2012-07-19 14:58:04
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547star

木虫 (著名写手)

引用回帖:
32楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 14:58:04
多谢~我自己设计过先用34退火,然后加25退火延伸,再加16,似乎不成,在体系和条件上有什么要注意的么?...

你设计的不是TBIO策略的引物,用这个方法不行的。
为什么
33楼2012-07-19 16:31:34
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wy135033405

木虫 (小有名气)

引用回帖:
33楼: Originally posted by 547star at 2012-07-19 16:31:34
你设计的不是TBIO策略的引物,用这个方法不行的。...

谢谢,那么31L提供的方案可以一试么?
34楼2012-07-19 16:45:48
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 14:58:04
多谢~我自己设计过先用34退火,然后加25退火延伸,再加16,似乎不成,在体系和条件上有什么要注意的么?...

不会呀,你确定实现将34退火延伸,产物纯化或割胶为模板后以25为引物做一个完整的PCR,循环30次,后面同前,没有结果么?
另外,你第一步的产物确定没问题么?
我以前就这样搞得,没问题呀。
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
35楼2012-07-19 19:27:20
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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wy135033405: 金币+50, ★★★很有帮助, pcr的水 略深啊! 2012-07-19 20:58:59
引用回帖:
34楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 16:45:48
谢谢,那么31L提供的方案可以一试么?...

你的p2,p5没有扩增区,跟人家的不同.你需要的是OR-PCR或者LCR,找下熊爱生老师的论文看看,http://www.nature.com/nprot/jour ... nprot.2006.103.html
为什么
36楼2012-07-19 20:10:33
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547star

木虫 (著名写手)

为什么
37楼2012-07-19 20:17:32
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nmhsd

木虫 (正式写手)

引用回帖:
30楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-18 10:14:23
您确定不是反讽?我这也是无奈之举嘛……...

我只是想知道怎么能做出来。绝无其他意思。
38楼2012-07-19 21:55:32
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

得了50分,是第2次得这么多金币,最多的一次是今年注册7周年领的金币。不说点,似乎对不住楼主。
通常基因合成的方法有OE-PCR,连接酶PCR(LCR)和TBIO,其他都是这些方法的变种。有时间可以看看高朝辉博士论文<<基因合成方法的改进与验证>> ,http://nar.oxfordjournals.org/content/31/22/e143.full.pdf+htmlhttp://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e67.full.pdf+html
http://nar.oxfordjournals.org/content/32/7/e59.full.pdf+html
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/44/
另外,超大片段采用酵母体内重组,见http://www.sciencedaily.com/releases/2008/01/080124175924.htm
http://www.marcottelab.org/users/CH391L/Handouts/JCVI-1.0.pdf
如前面所说,600bp以内的片段都比较容易合成,大的片段就不一定了,比如TBIO,没有改进方法seqTBIO(BMC那篇参考文献)好,我前面说的方法可以看做是seqTBIO的OE-PCR版本,需要你自己摸索一下条件。老实说,如果还没合成引物或者为了论文内容丰富点,你可以重新合成不同的引物来试,简单点,比如合成两条59bp的引物重叠区11bp虽然短了点,说不好一次几个循环的PCR就得到目的片段了。
为什么
39楼2012-07-19 22:07:09
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547star

木虫 (著名写手)

Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ ... 7417/pdf/gkp687.pdf
为什么
40楼2012-07-19 22:22:53
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