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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 无模板pcr合成短片段 一直失败
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流解答问题 2012-07-19 15:22:08
这个我做过，当时更长，引物差不多有80-90bp左右的引物，一次次的加长，其实也很简单。你的引物这么短，应该更好做点。首先将1、2、3加进去，你调整一下浓度，大概的比例是1、2、3递增。然后割胶回收，同样的方法就能得到更长的片段。
最简单的办法就是一次一次加长，首先将12退火延伸，以其产物为模板，以1、3为引物，以次类推，得到107bp片段。
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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
31楼2012-07-19 12:12:06
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
31楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2012-07-19 12:12:06
这个我做过，当时更长，引物差不多有80-90bp左右的引物，一次次的加长，其实也很简单。你的引物这么短，应该更好做点。首先将1、2、3加进去，你调整一下浓度，大概的比例是1、2、3递增。然后割胶回收，同样的方法就 ...

多谢~我自己设计过先用34退火，然后加25退火延伸，再加16，似乎不成，在体系和条件上有什么要注意的么？
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32楼2012-07-19 14:58:04
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 14:58:04
多谢~我自己设计过先用34退火，然后加25退火延伸，再加16，似乎不成，在体系和条件上有什么要注意的么？...

你设计的不是TBIO策略的引物，用这个方法不行的。
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为什么
33楼2012-07-19 16:31:34
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by 547star at 2012-07-19 16:31:34
你设计的不是TBIO策略的引物，用这个方法不行的。...

谢谢，那么31L提供的方案可以一试么？
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34楼2012-07-19 16:45:48
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 14:58:04
多谢~我自己设计过先用34退火，然后加25退火延伸，再加16，似乎不成，在体系和条件上有什么要注意的么？...

不会呀，你确定实现将34退火延伸，产物纯化或割胶为模板后以25为引物做一个完整的PCR，循环30次，后面同前，没有结果么？
另外，你第一步的产物确定没问题么？
我以前就这样搞得，没问题呀。
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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
35楼2012-07-19 19:27:20
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wy135033405: 金币+50, ★★★很有帮助, pcr的水 略深啊！ 2012-07-19 20:58:59
引用回帖:
34楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-19 16:45:48
谢谢，那么31L提供的方案可以一试么？...

你的p2,p5没有扩增区,跟人家的不同.你需要的是OR-PCR或者LCR，找下熊爱生老师的论文看看，http://www.nature.com/nprot/jour ... nprot.2006.103.html
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为什么
36楼2012-07-19 20:10:33
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547star

木虫 (著名写手)
http://nar.oxfordjournals.org/content/32/12/e98.abstract
http://wenku.baidu.com/view/139e364d2b160b4e767fcfc7.html
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为什么
37楼2012-07-19 20:17:32
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nmhsd

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-18 10:14:23
您确定不是反讽？我这也是无奈之举嘛……...

我只是想知道怎么能做出来。绝无其他意思。
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38楼2012-07-19 21:55:32
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

得了50分，是第2次得这么多金币，最多的一次是今年注册7周年领的金币。不说点，似乎对不住楼主。
通常基因合成的方法有OE-PCR,连接酶PCR(LCR)和TBIO,其他都是这些方法的变种。有时间可以看看高朝辉博士论文<<基因合成方法的改进与验证>> ，http://nar.oxfordjournals.org/content/31/22/e143.full.pdf+html，http://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e67.full.pdf+html，
http://nar.oxfordjournals.org/content/32/7/e59.full.pdf+html，
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/44/。
另外，超大片段采用酵母体内重组，见http://www.sciencedaily.com/releases/2008/01/080124175924.htm
http://www.marcottelab.org/users/CH391L/Handouts/JCVI-1.0.pdf 。
如前面所说，600bp以内的片段都比较容易合成，大的片段就不一定了，比如TBIO，没有改进方法seqTBIO(BMC那篇参考文献）好，我前面说的方法可以看做是seqTBIO的OE-PCR版本，需要你自己摸索一下条件。老实说，如果还没合成引物或者为了论文内容丰富点，你可以重新合成不同的引物来试，简单点，比如合成两条59bp的引物重叠区11bp虽然短了点，说不好一次几个循环的PCR就得到目的片段了。
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为什么
39楼2012-07-19 22:07:09
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547star

木虫 (著名写手)
Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ ... 7417/pdf/gkp687.pdf
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为什么
40楼2012-07-19 22:22:53
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