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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 无模板pcr合成短片段 一直失败
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wy135033405

木虫 (小有名气)

[求助] 无模板pcr合成短片段 一直失败

在下需要合成的片段为107bp，为了节省开支，设计了6条短引物，以数字大致表示如下（一条链的5' 端为起点，互补链也从该方向计数，加' 表示）：

p1: 1-30  p2：15'-45'  p3: 31-60 p4: 46'-75'  p5: 60-90 p6: 76'-107'

如图

6条引物去除重叠部分可以拼凑成目的片段，目前使用多种酶、体系、反应条件均无法p出目的片段，在不重新设计引物的条件下，请大家提供些意见。本帖只为求助，如果确实通过您的方案做出结果，另赠100金币，绝不食言。

图示
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sunny_andy 小马步步高

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1楼 2012-07-16 15:29:43
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

得了50分，是第2次得这么多金币，最多的一次是今年注册7周年领的金币。不说点，似乎对不住楼主。
通常基因合成的方法有OE-PCR,连接酶PCR(LCR)和TBIO,其他都是这些方法的变种。有时间可以看看高朝辉博士论文<<基因合成方法的改进与验证>> ，http://nar.oxfordjournals.org/content/31/22/e143.full.pdf+html，http://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e67.full.pdf+html，
http://nar.oxfordjournals.org/content/32/7/e59.full.pdf+html，
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/44/。
另外，超大片段采用酵母体内重组，见http://www.sciencedaily.com/releases/2008/01/080124175924.htm
http://www.marcottelab.org/users/CH391L/Handouts/JCVI-1.0.pdf 。
如前面所说，600bp以内的片段都比较容易合成，大的片段就不一定了，比如TBIO，没有改进方法seqTBIO(BMC那篇参考文献）好，我前面说的方法可以看做是seqTBIO的OE-PCR版本，需要你自己摸索一下条件。老实说，如果还没合成引物或者为了论文内容丰富点，你可以重新合成不同的引物来试，简单点，比如合成两条59bp的引物重叠区11bp虽然短了点，说不好一次几个循环的PCR就得到目的片段了。
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为什么
39楼2012-07-19 22:07:09
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查看全部 45 个回答

wcg129

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-16 20:17:58
wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:45
本帖内容被屏蔽

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wy135033405
2楼2012-07-16 17:10:17
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:33
可以考虑先加入三段进行PCR15个循环，然后再加入后三段引物进行PCR30循环，我之前试过这样做，希望可以给予你帮助。
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wy135033405
3楼2012-07-16 19:06:30
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wy135033405

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wcg129 at 2012-07-16 17:10:17
107bp
这样做省不了多少钱，直接合成也才几百块钱
个人觉得合成还经济些，主要是合成时间要10+天，慢

真的要这么做可以试试
但是看你的设计不是很理解，你P2/P4/P6是和P1/P3/P5序列在同一条链上还是互补链？
...

唉，直接合成的话论文就少了一部分内容嘛……但是实际上我已经做了超过十天了，而且各种酶和marker之类的估计也抵过省下那点钱了……

是互补链，能不能详细讲一下？
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4楼2012-07-16 20:41:16
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