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wy135033405木虫 (小有名气)
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[求助]
无模板pcr合成短片段 一直失败
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在下需要合成的片段为107bp，为了节省开支，设计了6条短引物，以数字大致表示如下（一条链的5' 端为起点，互补链也从该方向计数，加' 表示）： p1: 1-30 p2：15'-45' p3: 31-60 p4: 46'-75' p5: 60-90 p6: 76'-107' 如图 6条引物去除重叠部分可以拼凑成目的片段，目前使用多种酶、体系、反应条件均无法p出目的片段，在不重新设计引物的条件下，请大家提供些意见。本帖只为求助，如果确实通过您的方案做出结果，另赠100金币，绝不食言。  图示 |
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【答案】应助回帖
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得了50分，是第2次得这么多金币，最多的一次是今年注册7周年领的金币。不说点，似乎对不住楼主。 通常基因合成的方法有OE-PCR,连接酶PCR(LCR)和TBIO,其他都是这些方法的变种。有时间可以看看高朝辉博士论文<<基因合成方法的改进与验证>> ，http://nar.oxfordjournals.org/content/31/22/e143.full.pdf+html，http://nar.oxfordjournals.org/content/28/12/e67.full.pdf+html， http://nar.oxfordjournals.org/content/32/7/e59.full.pdf+html， http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/44/。 另外，超大片段采用酵母体内重组，见http://www.sciencedaily.com/releases/2008/01/080124175924.htm http://www.marcottelab.org/users/CH391L/Handouts/JCVI-1.0.pdf 。 如前面所说，600bp以内的片段都比较容易合成，大的片段就不一定了，比如TBIO，没有改进方法seqTBIO(BMC那篇参考文献）好，我前面说的方法可以看做是seqTBIO的OE-PCR版本，需要你自己摸索一下条件。老实说，如果还没合成引物或者为了论文内容丰富点，你可以重新合成不同的引物来试，简单点，比如合成两条59bp的引物重叠区11bp虽然短了点，说不好一次几个循环的PCR就得到目的片段了。 |
39楼2012-07-19 22:07:09
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-16 20:17:58
wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:45
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wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:45
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）
2楼2012-07-16 17:10:17
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
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wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:33
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wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:33
| 可以考虑先加入三段进行PCR15个循环，然后再加入后三段引物进行PCR30循环，我之前试过这样做，希望可以给予你帮助。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
3楼2012-07-16 19:06:30
wy135033405
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
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- 散金: 77
- 红花: 7
- 帖子: 94
- 在线: 46.4小时
- 虫号: 1096008
- 注册: 2010-09-11
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2012-07-16 20:41:16