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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 无模板pcr合成短片段 一直失败
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wy135033405

木虫 (小有名气)

[求助] 无模板pcr合成短片段 一直失败

在下需要合成的片段为107bp，为了节省开支，设计了6条短引物，以数字大致表示如下（一条链的5' 端为起点，互补链也从该方向计数，加' 表示）：

p1: 1-30  p2：15'-45'  p3: 31-60 p4: 46'-75'  p5: 60-90 p6: 76'-107'

如图

6条引物去除重叠部分可以拼凑成目的片段，目前使用多种酶、体系、反应条件均无法p出目的片段，在不重新设计引物的条件下，请大家提供些意见。本帖只为求助，如果确实通过您的方案做出结果，另赠100金币，绝不食言。

图示
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sunny_andy 小马步步高

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1楼 2012-07-16 15:29:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wcg129

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-16 20:17:58
wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:45
本帖内容被屏蔽

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wy135033405
2楼2012-07-16 17:10:17
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这么短的片段不需要PCR，两两退火，磷酸化之后连接起来就可以了
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10楼2012-07-16 23:10:46
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wy135033405: 金币+10, ★★★很有帮助, 又一种思路，受益良多。 2012-07-17 16:26:18
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:46:12
引用回帖:
11楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-17 08:08:08
感谢指导，能否提供具体一点的方案？...

先将p2、p3、p4、p5使用PNK（磷酸激酶）磷酸化并灭活，再将p1与p2、p3与p4、p5与p6分别退火，最后将三者用T4 DNA连接酶连接起来。
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22楼2012-07-17 15:16:52
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普通回帖

84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wy135033405: 金币+5, ★有帮助 2012-07-17 11:34:33
可以考虑先加入三段进行PCR15个循环，然后再加入后三段引物进行PCR30循环，我之前试过这样做，希望可以给予你帮助。
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wy135033405
3楼2012-07-16 19:06:30
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wy135033405

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wcg129 at 2012-07-16 17:10:17
107bp
这样做省不了多少钱，直接合成也才几百块钱
个人觉得合成还经济些，主要是合成时间要10+天，慢

真的要这么做可以试试
但是看你的设计不是很理解，你P2/P4/P6是和P1/P3/P5序列在同一条链上还是互补链？
...

唉，直接合成的话论文就少了一部分内容嘛……但是实际上我已经做了超过十天了，而且各种酶和marker之类的估计也抵过省下那点钱了……

是互补链，能不能详细讲一下？
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4楼2012-07-16 20:41:16
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wy135033405

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 84146922 at 2012-07-16 19:06:30
可以考虑先加入三段进行PCR15个循环，然后再加入后三段引物进行PCR30循环，我之前试过这样做，希望可以给予你帮助。

谢谢，我明天试试看，目前做过直接加入6个引物p10个循环，然后加两短引物30个循环，结果也不理想。希望您的方法有效哈~
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5楼2012-07-16 20:42:59
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
P1，P6 浓度10P,作为PCR体系的两端引物，分别取1ul
P2，P3，P4，P5 混在一起，混合物中每条的浓度1p, 取1ul,作为模板
退火温度55C,  30个循环
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wy135033405
6楼2012-07-16 20:55:51
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wy135033405

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by xmchen1015 at 2012-07-16 20:55:51
P1，P6 浓度10P,作为PCR体系的两端引物，分别取1ul
P2，P3，P4，P5 混在一起，混合物中每条的浓度1p, 取1ul,作为模板
退火温度55C,  30个循环

唉，您这个方法就是我在用的，p1 p6 20mM p2-p5 2mM，体系中各1uL， 其余一样，电泳无条带。
我还采用p1-p6 2mM 各1ul，10个循环后再添加p1，p6 20mM各1uL的方法，同样无效。不过多谢指导。
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7楼2012-07-16 21:02:32
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 虫虫最近很活跃哈，谢谢对分子版的支持 2012-07-18 13:46:43
还是直接合成吧，这种搭桥PCR不好做，建议你用最贵的聚合酶来做，我以前同学有做的，比较难
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8楼2012-07-16 21:43:22
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-16 21:43:22
还是直接合成吧，这种搭桥PCR不好做，建议你用最贵的聚合酶来做，我以前同学有做的，比较难

我现在用的就很贵了……是很难……感谢回复。
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9楼2012-07-16 21:59:08
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