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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 无模板pcr合成短片段 一直失败
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547star

木虫 (著名写手)
片段小,需要延伸的长度短,基本上延伸5秒就可以了,7个循环也就几分钟,应该很快的.没有复杂结构的基因合成600bp内都很容易得到。关键在于排除突变，循环次数不要多,一定要高保真酶，有mutS结合突变序列来排除就更好了。
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wy135033405
为什么
21楼2012-07-17 12:54:54
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wy135033405: 金币+10, ★★★很有帮助, 又一种思路，受益良多。 2012-07-17 16:26:18
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:46:12
引用回帖:
11楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-17 08:08:08
感谢指导，能否提供具体一点的方案？...

先将p2、p3、p4、p5使用PNK（磷酸激酶）磷酸化并灭活，再将p1与p2、p3与p4、p5与p6分别退火，最后将三者用T4 DNA连接酶连接起来。
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22楼2012-07-17 15:16:52
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
22楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-07-17 15:16:52
先将p2、p3、p4、p5使用PNK（磷酸激酶）磷酸化并灭活，再将p1与p2、p3与p4、p5与p6分别退火，最后将三者用T4 DNA连接酶连接起来。...

写错了，PNK是多核苷酸激酶
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23楼2012-07-17 15:21:11
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wy135033405

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by 547star at 2012-07-17 12:54:54
片段小,需要延伸的长度短,基本上延伸5秒就可以了,7个循环也就几分钟,应该很快的.没有复杂结构的基因合成600bp内都很容易得到。关键在于排除突变，循环次数不要多,一定要高保真酶，有mutS结合突变序列来排除就更好了 ...

感谢~
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24楼2012-07-17 16:25:21
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wy135033405

木虫 (小有名气)
wy135033405: 回帖置顶 2012-07-17 16:30:05
追加了100金币，以供出结果时赠予方案提供者，欢迎继续提出思路，如果有帮助我会酌情给分。
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25楼2012-07-17 16:29:51
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wcg129

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
26楼2012-07-17 16:49:23
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nmhsd

木虫 (正式写手)
太神奇了，这样的PCR。楼主哪一天P出来了，别忘了，告诉我们如何操作的？拭目以待啊！
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27楼2012-07-18 00:23:07
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还能这样做啊，学习了，不过确实没有必要哦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
28楼2012-07-18 07:41:03
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huanhuanyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还是直接合成吧，这种搭桥PCR不好做，建议你用最贵的聚合酶来做
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29楼2012-07-18 08:37:42
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by nmhsd at 2012-07-18 00:23:07
太神奇了，这样的PCR。楼主哪一天P出来了，别忘了，告诉我们如何操作的？拭目以待啊！

您确定不是反讽？我这也是无奈之举嘛……
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30楼2012-07-18 10:14:23
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