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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 无模板pcr合成短片段 一直失败
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-07-16 23:10:46
这么短的片段不需要PCR，两两退火，磷酸化之后连接起来就可以了

感谢指导，能否提供具体一点的方案？
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11楼2012-07-17 08:08:08
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wy135033405: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-17 11:35:30
还是坚持继续PCR吧，实不相瞒，我刚进研一的时候，主要上课，老板让我练手，做了一个32段的，整整P了2个月才将条件确定了。因为那时的PCR仪器只有最简单的，什么梯度，降落都没有。最后就苦闷了2个月才OK。个人建议降低退火温度，延长退火时间试试看。
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12楼2012-07-17 09:07:02
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 09:07:02
还是坚持继续PCR吧，实不相瞒，我刚进研一的时候，主要上课，老板让我练手，做了一个32段的，整整P了2个月才将条件确定了。因为那时的PCR仪器只有最简单的，什么梯度，降落都没有。最后就苦闷了2个月才OK。个人建议 ...

十分感谢，我这个一比就小儿科了啊，32段，您老板也是奇葩……
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13楼2012-07-17 09:27:11
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-17 09:27:11
十分感谢，我这个一比就小儿科了啊，32段，您老板也是奇葩……...

呵呵，做过了就还好，一起共勉。
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14楼2012-07-17 10:07:09
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chlbio

新虫 (初入文坛)
还是合成比较快，四五百块，我1000bp都合成了
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15楼2012-07-17 10:16:44
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wcg129

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wy135033405: 金币+10, ★★★很有帮助, 十分感谢 2012-07-17 11:33:50
本帖内容被屏蔽
16楼2012-07-17 10:44:09
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wy135033405: 金币+10, ★★★很有帮助, 步骤最大化的思路哈，我试试看。 2012-07-17 12:34:30
引物配相同浓度。先分三组p1,p2;p3,p4;p5,p6分别PCR7个循环得产物F1,F2,F3，不用纯化，直接把F1与F2;F2与F3等体积混合继续PCR7个循环得产物F5,F6。取PCR体系1/20体积的F5和F6作为模板进行大体积PCR，胶回收目的片段。
F2与F1,F3混合的时候可以试试加少点，比如1/2体积。
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为什么
17楼2012-07-17 12:15:04
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547star

木虫 (著名写手)
F5和F6作为模板进行大体积PCR，这个时候用P1,P6做引物。
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为什么
18楼2012-07-17 12:23:01
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wy135033405: 金币+5, ★有帮助, 我太笨了，不是很懂…… 2012-07-17 12:53:05
片段太多，完全没有必要。
最多三个就可以了。

每个片段80bp，引物当成模板来用。引物设计两条，互补的序列也应设。
引物另设20-22bp即可。
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19楼2012-07-17 12:29:13
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wy135033405

木虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by wcg129 at 2012-07-17 10:44:09
你引物稀释成什么浓度的？
我们以前一般是50umol的，用P2 P3 P4 P5 稀释10倍（稀释后的浓度就是5umol），各1ul混合（也可以尝试P3和P4比P2和P5多些量），慢慢退火（在PCR仪上），94预变性1分钟，慢退火到4度，冰浴 ...

再问一下，我还是不很明白“慢慢退火（在PCR仪上）……慢退火到4度，”的含义，能否赐教？
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20楼2012-07-17 12:30:18
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