【答案】应助回帖

11楼2012-07-17 08:08:08

reallpf

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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wy135033405: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-17 11:35:30

还是坚持继续PCR吧，实不相瞒，我刚进研一的时候，主要上课，老板让我练手，做了一个32段的，整整P了2个月才将条件确定了。因为那时的PCR仪器只有最简单的，什么梯度，降落都没有。最后就苦闷了2个月才OK。个人建议降低退火温度，延长退火时间试试看。

12楼2012-07-17 09:07:02

wy135033405

木虫 (小有名气)

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引用回帖:

12楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 09:07:02
还是坚持继续PCR吧，实不相瞒，我刚进研一的时候，主要上课，老板让我练手，做了一个32段的，整整P了2个月才将条件确定了。因为那时的PCR仪器只有最简单的，什么梯度，降落都没有。最后就苦闷了2个月才OK。个人建议 ...

十分感谢，我这个一比就小儿科了啊，32段，您老板也是奇葩……

13楼2012-07-17 09:27:11

reallpf

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引用回帖:

13楼: Originally posted by wy135033405 at 2012-07-17 09:27:11
十分感谢，我这个一比就小儿科了啊，32段，您老板也是奇葩……...

呵呵，做过了就还好，一起共勉。

14楼2012-07-17 10:07:09

chlbio

新虫 (初入文坛)

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还是合成比较快，四五百块，我1000bp都合成了

15楼2012-07-17 10:16:44

wcg129

禁虫 (著名写手)

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wy135033405: 金币+10, ★★★很有帮助, 十分感谢 2012-07-17 11:33:50

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16楼2012-07-17 10:44:09

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wy135033405: 金币+10, ★★★很有帮助, 步骤最大化的思路哈，我试试看。 2012-07-17 12:34:30

引物配相同浓度。先分三组p1,p2;p3,p4;p5,p6分别PCR7个循环得产物F1,F2,F3，不用纯化，直接把F1与F2;F2与F3等体积混合继续PCR7个循环得产物F5,F6。取PCR体系1/20体积的F5和F6作为模板进行大体积PCR，胶回收目的片段。
F2与F1,F3混合的时候可以试试加少点，比如1/2体积。

为什么

17楼2012-07-17 12:15:04

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F5和F6作为模板进行大体积PCR，这个时候用P1,P6做引物。

为什么

18楼2012-07-17 12:23:01

yuzhiming

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wy135033405: 金币+5, ★有帮助, 我太笨了，不是很懂…… 2012-07-17 12:53:05

片段太多，完全没有必要。
最多三个就可以了。

每个片段80bp，引物当成模板来用。引物设计两条，互补的序列也应设。
引物另设20-22bp即可。

19楼2012-07-17 12:29:13

wy135033405

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引用回帖:

16楼: Originally posted by wcg129 at 2012-07-17 10:44:09
你引物稀释成什么浓度的？
我们以前一般是50umol的，用P2 P3 P4 P5 稀释10倍（稀释后的浓度就是5umol），各1ul混合（也可以尝试P3和P4比P2和P5多些量），慢慢退火（在PCR仪上），94预变性1分钟，慢退火到4度，冰浴 ...

再问一下，我还是不很明白“慢慢退火（在PCR仪上）……慢退火到4度，”的含义，能否赐教？

20楼2012-07-17 12:30:18