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wangcongxs银虫 (著名写手)
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[求助]
PCR不出带，求教
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| 我用酶切连接后的产物进行预扩增，退火温度度降到48度才有目的带（引物TM值一条55.75，一条52.18），然后把预扩增产物稀释10倍进行选扩增，跑6%的变性PAGE，PCR25ul的体系，buffer2.5ul，镁离子1.5，DNTP1.0，引物（10uM）1.5，rTaq0.3，PCR程序用touchdown，从65降至56。我用的是我们老师做的体系，只是模板不一样，可是物种是一样的，为什么一直扩不出带啊，难道预扩就是假阳性？但是退火温度高了只有弥散啊，请各位朋友帮忙提提意见……不胜感激！ |
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-10 13:46:20
wangcongxs: 金币+5 2012-07-17 08:07:35
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wangcongxs: 金币+5 2012-07-17 08:07:35
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预扩增用了48度才有的，之后是65降至56，在48度之上，没有产物似乎也有道理。 PCR体系中镁离子浓度也是关键，你可以查查，然后调整或者做梯度。 如果你们老师同样体系做出来，你没做出来，那就是模板有问题的可能性还是比较大的. 当然，你也要确定你的预扩增条带是正确的。 预扩增弥散的产物也可以试试往下做，可能是你的引物不够特异，扩出了其它，但应该包含你的目标吧？ 也不知道你是在做什么，所以只能这样回答些。 |
2楼2012-07-10 10:50:45
wangcongxs
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5楼2012-07-17 09:02:01
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谢谢！ 9楼2012-07-18 10:44:56
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