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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR不出带，求教
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 热心的虫虫，鼓励鼓励 2012-07-18 13:52:14
wangcongxs: 金币+2 2012-07-19 09:07:22
引用回帖:
7楼: Originally posted by wangcongxs at 2012-07-18 10:33:19
请问你的意思是用琼脂糖跑电泳看看吗？我做了感觉还可以……
你们一般怎么鉴定？谢谢...

如果你的预扩2增产物就是你的目的条带，那么第2次扩增怎么会扩增不出来呢？我觉得这个可能性不大，你肯定是中间过程出了问题，或者你的跑胶结果根本就是假阳性，你再看看吧，实在不行就测序吧
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11楼2012-07-18 11:43:27
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-18 11:01:10
一般Tm值算出后下调5-10度为宜...

谢谢！我的上下游引物Tm值均值为54我最低跑的退火温度是48，在地我怕是假阳性了…………
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做最好的自己
12楼2012-07-19 09:11:12
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-18 11:43:27
如果你的预扩2增产物就是你的目的条带，那么第2次扩增怎么会扩增不出来呢？我觉得这个可能性不大，你肯定是中间过程出了问题，或者你的跑胶结果根本就是假阳性，你再看看吧，实在不行就测序吧...

我做的植物全基因组还没有测序，也是参考了一些文献，目的带在那个范围内而已，测序可能不太合适，我想请教一下你们做酶切或是PCR前需要把DNA再纯化一下吗？担心模板问题……谢谢
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做最好的自己
13楼2012-07-19 09:15:19
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-19 15:10:12
先把预扩增产物测序，确定是你需要的，再做之后的实验。
如果预扩增是对的，把预扩增产物测浓度后再稀释，否则你的浓度无法把控，我原来做过扩增病毒，把PCR产物随便稀释了一下，老是扩出弥散，测浓度后再稀释到你需要的浓度就好了。引物太多了，就是，你的引物偏多，也有这种可能10个循环或者20个循环就把你的模板或者酶等（PCR体系中任意一成分被用完，PCR就终止了）就被用完了，导致弥散或者没有带或者带非常弱。如果确定没有这些原因，而PCR产物又太弥散，调整镁离子浓度和退火温度就可以了。
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14楼2012-07-19 10:19:51
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by wangcongxs at 2012-07-19 09:15:19
我做的植物全基因组还没有测序，也是参考了一些文献，目的带在那个范围内而已，测序可能不太合适，我想请教一下你们做酶切或是PCR前需要把DNA再纯化一下吗？担心模板问题……谢谢...

你的情况跟我一致，我也是做植物总DNA的，模板是我自己提的，可以用分光光度计测下浓度和OD值，260/280在1.8~2.0之间就可以了
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
15楼2013-07-22 19:05:41
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