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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR不出带，求教
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wangcongxs

银虫 (著名写手)

[求助] PCR不出带，求教

我用酶切连接后的产物进行预扩增，退火温度度降到48度才有目的带（引物TM值一条55.75，一条52.18），然后把预扩增产物稀释10倍进行选扩增，跑6%的变性PAGE，PCR25ul的体系，buffer2.5ul，镁离子1.5，DNTP1.0，引物（10uM）1.5，rTaq0.3，PCR程序用touchdown，从65降至56。我用的是我们老师做的体系，只是模板不一样，可是物种是一样的，为什么一直扩不出带啊，难道预扩就是假阳性？但是退火温度高了只有弥散啊，请各位朋友帮忙提提意见……不胜感激！
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做最好的自己
1楼 2012-07-10 10:24:09
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-19 15:10:12
先把预扩增产物测序，确定是你需要的，再做之后的实验。
如果预扩增是对的，把预扩增产物测浓度后再稀释，否则你的浓度无法把控，我原来做过扩增病毒，把PCR产物随便稀释了一下，老是扩出弥散，测浓度后再稀释到你需要的浓度就好了。引物太多了，就是，你的引物偏多，也有这种可能10个循环或者20个循环就把你的模板或者酶等（PCR体系中任意一成分被用完，PCR就终止了）就被用完了，导致弥散或者没有带或者带非常弱。如果确定没有这些原因，而PCR产物又太弥散，调整镁离子浓度和退火温度就可以了。
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14楼2012-07-19 10:19:51
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-10 13:46:20
wangcongxs: 金币+5 2012-07-17 08:07:35
预扩增用了48度才有的，之后是65降至56，在48度之上，没有产物似乎也有道理。
PCR体系中镁离子浓度也是关键，你可以查查，然后调整或者做梯度。
如果你们老师同样体系做出来，你没做出来，那就是模板有问题的可能性还是比较大的.
当然，你也要确定你的预扩增条带是正确的。
预扩增弥散的产物也可以试试往下做，可能是你的引物不够特异，扩出了其它，但应该包含你的目标吧？
也不知道你是在做什么，所以只能这样回答些。
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2楼2012-07-10 10:50:45
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-10 10:50:45
预扩增用了48度才有的，之后是65降至56，在48度之上，没有产物似乎也有道理。
PCR体系中镁离子浓度也是关键，你可以查查，然后调整或者做梯度。
如果你们老师同样体系做出来，你没做出来，那就是模板有问题的可能 ...

我做的是DNA甲基化，预扩中的条带长度应该是我的目的带，但是选扩增就扩不出来，如果说模板有问题，确实有些模板酶切切不开，但是我用的都是酶切弥散很好的，说明不是模板的问题啊，希望与您进一步交流，谢谢您提的意见……
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做最好的自己
3楼2012-07-17 08:10:38
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wangcongxs: 金币+1 2012-07-18 10:31:32
你为什么不把你的预扩增产物进行一下鉴定呢？
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4楼2012-07-17 08:56:53
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