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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR不出带，求教
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wangcongxs

银虫 (著名写手)

[求助] PCR不出带，求教

我用酶切连接后的产物进行预扩增，退火温度度降到48度才有目的带（引物TM值一条55.75，一条52.18），然后把预扩增产物稀释10倍进行选扩增，跑6%的变性PAGE，PCR25ul的体系，buffer2.5ul，镁离子1.5，DNTP1.0，引物（10uM）1.5，rTaq0.3，PCR程序用touchdown，从65降至56。我用的是我们老师做的体系，只是模板不一样，可是物种是一样的，为什么一直扩不出带啊，难道预扩就是假阳性？但是退火温度高了只有弥散啊，请各位朋友帮忙提提意见……不胜感激！
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做最好的自己
1楼 2012-07-10 10:24:09
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-10 13:46:20
wangcongxs: 金币+5 2012-07-17 08:07:35
预扩增用了48度才有的，之后是65降至56，在48度之上，没有产物似乎也有道理。
PCR体系中镁离子浓度也是关键，你可以查查，然后调整或者做梯度。
如果你们老师同样体系做出来，你没做出来，那就是模板有问题的可能性还是比较大的.
当然，你也要确定你的预扩增条带是正确的。
预扩增弥散的产物也可以试试往下做，可能是你的引物不够特异，扩出了其它，但应该包含你的目标吧？
也不知道你是在做什么，所以只能这样回答些。
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2楼2012-07-10 10:50:45
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-10 10:50:45
预扩增用了48度才有的，之后是65降至56，在48度之上，没有产物似乎也有道理。
PCR体系中镁离子浓度也是关键，你可以查查，然后调整或者做梯度。
如果你们老师同样体系做出来，你没做出来，那就是模板有问题的可能 ...

我做的是DNA甲基化，预扩中的条带长度应该是我的目的带，但是选扩增就扩不出来，如果说模板有问题，确实有些模板酶切切不开，但是我用的都是酶切弥散很好的，说明不是模板的问题啊，希望与您进一步交流，谢谢您提的意见……
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做最好的自己
3楼2012-07-17 08:10:38
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wangcongxs: 金币+1 2012-07-18 10:31:32
你为什么不把你的预扩增产物进行一下鉴定呢？
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4楼2012-07-17 08:56:53
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人建议你讲预扩增产物稀释50倍后用试试，另外根据引物算出的Tm值，建议你的touch down程序温度变为从60-51或者更低。
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5楼2012-07-17 09:02:01
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shenye.judy

木虫 (正式写手)
DNA甲基化我也没做过，有同学做过，关于PCR，好的体系有很多条件需要摸索，上面的提了一些还不错的意见，可以多设计一些条件摸索一下。
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6楼2012-07-17 19:12:17
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-17 08:56:53
你为什么不把你的预扩增产物进行一下鉴定呢？

请问你的意思是用琼脂糖跑电泳看看吗？我做了感觉还可以……
你们一般怎么鉴定？谢谢
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做最好的自己
7楼2012-07-18 10:33:19
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 09:02:01
个人建议你讲预扩增产物稀释50倍后用试试，另外根据引物算出的Tm值，建议你的touch down程序温度变为从60-51或者更低。

要稀释那么多吗？我以前稀释10倍、20倍25的体系家5微升，现在我直接用原液1微升.我昨天用touchdown退火温度从60-48，然后55度扩增的有带，但主要在1500bp以上，我发现做甲基化的很多文章选扩都是用的一模一样的程序，touchdown 65-56度13cycles，然后用56度23cycles…………
  TM值我也算过，但是应该取上下游引物的平均值呢，还是在平均值得基础上上下浮动5-10度？有什么好的建议吗？谢谢
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做最好的自己
8楼2012-07-18 10:42:03
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wangcongxs

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-17 19:12:17
DNA甲基化我也没做过，有同学做过，关于PCR，好的体系有很多条件需要摸索，上面的提了一些还不错的意见，可以多设计一些条件摸索一下。

恩，你能告诉我你同学的虫号吗？交流一下谢谢！
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做最好的自己
9楼2012-07-18 10:44:56
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wangcongxs: 金币+2 2012-07-19 09:08:23
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangcongxs at 2012-07-18 10:42:03
要稀释那么多吗？我以前稀释10倍、20倍25的体系家5微升，现在我直接用原液1微升.我昨天用touchdown退火温度从60-48，然后55度扩增的有带，但主要在1500bp以上，我发现做甲基化的很多文章选扩都是用的一模一样的程序 ...

一般Tm值算出后下调5-10度为宜
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10楼2012-07-18 11:01:10
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