应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间
231/3返回列表123下一页
查看: 3846  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

auau96

新虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间 已有2人参与

大家好  我现在在做酿酒酵母基因敲除  利用左右同源臂各390bp和540bp  因为本身菌株遗传背景不清楚  MARKER基因既不是抗性基因和也不是缺陷型基因     用能表达的酶基因做筛选标记   不知各位前辈是否有此类实验经验来敲除目的基因   
实验顺利大概需多少时间能完成
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-06-05 11:03:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

我的天堂

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:03:09
一般的G418或其他氨基酸筛选标记敲除，从设计引物到拿到菌，顺利的话10天左右。这类筛选都是正筛选，只要是平板上长的，很多是阳性菌落，所以很快。不知你的酶是如何筛选的，若是负筛选会比较麻烦。
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

auau96
Healtheworld.
6楼2012-06-06 17:13:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

auau96

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 我的天堂 at 2012-06-06 17:13:49
一般的G418或其他氨基酸筛选标记敲除，从设计引物到拿到菌，顺利的话10天左右。这类筛选都是正筛选，只要是平板上长的，很多是阳性菌落，所以很快。不知你的酶是如何筛选的，若是负筛选会比较麻烦。

谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转化造成了突变还是左右臂不够长 左臂390bp 右臂540bp
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2012-06-06 21:10:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:02:49
基本不可行...单纯一个酶，很难用水解圈筛选。另一方面，酵母的蛋白表达量不高，也会影响你的筛选.仅供参考..
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2012-06-07 12:06:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 21:29:42
不知酶基因是什么，选择不好效率太差了。你可以用一些显性的遗传标记啊，比如抗G418的基因作为筛选标记。这样的话，把同源序列克隆到标记上下游，酶切一下，一次就筛选出来。
赞一下 回复此楼
2楼2012-06-05 13:41:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

caoluoyuan

金虫 (正式写手)
★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 21:29:36
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统
赞一下 回复此楼
3楼2012-06-05 14:57:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:03:00
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统
赞一下 回复此楼
4楼2012-06-05 14:58:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

auau96

新虫 (小有名气)
谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路：利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 同时敲掉目的基因
即   左侧同源臂（启动子）+酶的CDS序列+右侧同源臂（终止子）  
由于之前实验室并没有做过敲除 还不知此思路是否可行  
望各位不吝赐教  谢谢
赞一下 回复此楼
5楼2012-06-05 15:23:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也正在做敲除 不过是原核  抗性筛选 觉得很顺利的话 至少一个月吧
赞一下 回复此楼
7楼2012-06-06 17:22:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

auau96

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-05 13:41:30
不知酶基因是什么，选择不好效率太差了。你可以用一些显性的遗传标记啊，比如抗G418的基因作为筛选标记。这样的话，把同源序列克隆到标记上下游，酶切一下，一次就筛选出来。

用的是纤维素酶基因  但是只用了它的CDS序列  想利用被敲基因ORF上下游做启动子和终止子  想达到及表达标记基因 也替换被敲基因的ORF

可能这样的设计有问题
不知前辈有何高见  请赐教  谢谢
赞一下 回复此楼
9楼2012-06-06 21:13:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

iaminxanadu

木虫 (正式写手)
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达（分泌或细胞表面展示）的前提下，可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时，构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话，在验证了理论可行后，就先试试吧
个人感觉有难度。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

auau96
10楼2012-06-07 08:38:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 auau96 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 284求调剂 +12 archer.. 2026-04-10 13/650 2026-04-11 08:44 by zhq0425
[考研] 085506-求调剂-285分 +3 雷欧飞踢 2026-04-08 3/150 2026-04-11 08:37 by zhq0425
[考研] 281求调剂 +10 觉得好的吧 2026-04-10 10/500 2026-04-11 08:31 by zhq0425
[考研] 277 数一104，学硕，求调剂 +18 瓶子PZ 2026-04-09 19/950 2026-04-11 08:29 by zhq0425
[考研] 296求调剂 +12 汪！？！ 2026-04-10 14/700 2026-04-11 08:24 by zhq0425
[考研] 一志愿西北工业大学289 085602 +31 yang婷 2026-04-10 31/1550 2026-04-11 00:19 by gong120082
[考研] 302分求调剂 +9 凡语祈愿 2026-04-08 10/500 2026-04-10 23:26 by 314126402
[考研] 263能源动力专硕求调剂 +3 加大号饭盒袋 2026-04-10 3/150 2026-04-10 22:23 by 286640313
[考研] 280求调剂 +12 李rien 2026-04-04 12/600 2026-04-10 21:19 by zhouxiaoyu
[考研] 282，电气工程专业，求调剂，不挑专业 +9 jggshjkkm 2026-04-10 9/450 2026-04-10 14:55 by 逆水乘风
[考研] 22408 352分求调剂0854类 +3 努力的夏末 2026-04-09 3/150 2026-04-10 10:12 by 314126402
[考研] 284求调剂 +7 让我上岸吧阿西 2026-04-09 7/350 2026-04-09 18:59 by haironglove
[考研] 一志愿中科院105500专业总分315求调剂 +6 lallalh 2026-04-09 7/350 2026-04-09 17:51 by lallalh
[考研] 299求调剂 +6 ZVVZ13 2026-04-08 6/300 2026-04-09 15:48 by wp06
[考研] 材料考研求调剂总分280 +30 mkjlz1 2026-04-06 35/1750 2026-04-08 21:25 by cyh—315
[考研] 化工学硕 285求调剂 +26 Wisjxn 2026-04-07 26/1300 2026-04-08 14:42 by screening
[考研] 305求调剂 +4 77Qi 2026-04-06 4/200 2026-04-07 20:06 by shanqishi
[考研] 085404 293求调剂 +8 勇远库爱314 2026-04-06 9/450 2026-04-07 13:05 by flydream1314
[考研] 一志愿9材料学硕297已过六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-04-04 12/600 2026-04-05 19:04 by 蓝云思雨
[考研] 考研调剂 +11 小sun要好运 2026-04-04 11/550 2026-04-05 08:02 by qlm5820
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭