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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间
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auau96

新虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间已有2人参与

大家好  我现在在做酿酒酵母基因敲除  利用左右同源臂各390bp和540bp  因为本身菌株遗传背景不清楚  MARKER基因既不是抗性基因和也不是缺陷型基因     用能表达的酶基因做筛选标记   不知各位前辈是否有此类实验经验来敲除目的基因   
实验顺利大概需多少时间能完成
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1楼2012-06-05 11:03:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

我的天堂

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:03:09
一般的G418或其他氨基酸筛选标记敲除，从设计引物到拿到菌，顺利的话10天左右。这类筛选都是正筛选，只要是平板上长的，很多是阳性菌落，所以很快。不知你的酶是如何筛选的，若是负筛选会比较麻烦。
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auau96
Healtheworld.
6楼2012-06-06 17:13:49
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auau96

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 我的天堂 at 2012-06-06 17:13:49
一般的G418或其他氨基酸筛选标记敲除，从设计引物到拿到菌，顺利的话10天左右。这类筛选都是正筛选，只要是平板上长的，很多是阳性菌落，所以很快。不知你的酶是如何筛选的，若是负筛选会比较麻烦。

谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转化造成了突变还是左右臂不够长 左臂390bp 右臂540bp
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8楼2012-06-06 21:10:02
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:02:49
基本不可行...单纯一个酶，很难用水解圈筛选。另一方面，酵母的蛋白表达量不高，也会影响你的筛选.仅供参考..
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12楼2012-06-07 12:06:26
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普通回帖

iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 21:29:42
不知酶基因是什么，选择不好效率太差了。你可以用一些显性的遗传标记啊，比如抗G418的基因作为筛选标记。这样的话，把同源序列克隆到标记上下游，酶切一下，一次就筛选出来。
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2楼2012-06-05 13:41:30
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)
★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 21:29:36
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统
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3楼2012-06-05 14:57:55
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:03:00
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统
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4楼2012-06-05 14:58:08
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auau96

新虫 (小有名气)
谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路：利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 同时敲掉目的基因
即   左侧同源臂（启动子）+酶的CDS序列+右侧同源臂（终止子）  
由于之前实验室并没有做过敲除 还不知此思路是否可行  
望各位不吝赐教  谢谢
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5楼2012-06-05 15:23:20
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也正在做敲除 不过是原核  抗性筛选 觉得很顺利的话 至少一个月吧
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7楼2012-06-06 17:22:52
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auau96

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-05 13:41:30
不知酶基因是什么，选择不好效率太差了。你可以用一些显性的遗传标记啊，比如抗G418的基因作为筛选标记。这样的话，把同源序列克隆到标记上下游，酶切一下，一次就筛选出来。

用的是纤维素酶基因  但是只用了它的CDS序列  想利用被敲基因ORF上下游做启动子和终止子  想达到及表达标记基因 也替换被敲基因的ORF

可能这样的设计有问题
不知前辈有何高见  请赐教  谢谢
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9楼2012-06-06 21:13:34
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达（分泌或细胞表面展示）的前提下，可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时，构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话，在验证了理论可行后，就先试试吧
个人感觉有难度。
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auau96
10楼2012-06-07 08:38:28
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