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auau96

新虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间 已有2人参与

大家好  我现在在做酿酒酵母基因敲除  利用左右同源臂各390bp和540bp  因为本身菌株遗传背景不清楚  MARKER基因既不是抗性基因和也不是缺陷型基因     用能表达的酶基因做筛选标记   不知各位前辈是否有此类实验经验来敲除目的基因   
实验顺利大概需多少时间能完成
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auau96

新虫 (小有名气)

谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路:利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 同时敲掉目的基因
即   左侧同源臂(启动子)+酶的CDS序列+右侧同源臂(终止子)  
由于之前实验室并没有做过敲除 还不知此思路是否可行  
望各位不吝赐教  谢谢
5楼2012-06-05 15:23:20
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auau96

新虫 (小有名气)

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引用回帖:
6楼: Originally posted by 我的天堂 at 2012-06-06 17:13:49
一般的G418或其他氨基酸筛选标记敲除,从设计引物到拿到菌,顺利的话10天左右。这类筛选都是正筛选,只要是平板上长的,很多是阳性菌落,所以很快。不知你的酶是如何筛选的,若是负筛选会比较麻烦。

谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转化造成了突变还是左右臂不够长 左臂390bp 右臂540bp
8楼2012-06-06 21:10:02
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auau96

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-05 13:41:30
不知酶基因是什么,选择不好效率太差了。你可以用一些显性的遗传标记啊,比如抗G418的基因作为筛选标记。这样的话,把同源序列克隆到标记上下游,酶切一下,一次就筛选出来。

用的是纤维素酶基因  但是只用了它的CDS序列  想利用被敲基因ORF上下游做启动子和终止子  想达到及表达标记基因 也替换被敲基因的ORF

可能这样的设计有问题
不知前辈有何高见  请赐教  谢谢
9楼2012-06-06 21:13:34
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auau96

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-07 08:38:28
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达(分泌或细胞表面展示)的前提下,可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时,构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话 ...

谢谢前辈的箴言  敲除实验正在不断进行  准备同时转换思路  改变基因敲除盒片段 可能还得花一段时间才有大进展  
祝工作顺利
11楼2012-06-07 11:03:07
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