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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间
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auau96

新虫 (小有名气)

[求助] 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间 已有2人参与

大家好  我现在在做酿酒酵母基因敲除  利用左右同源臂各390bp和540bp  因为本身菌株遗传背景不清楚  MARKER基因既不是抗性基因和也不是缺陷型基因     用能表达的酶基因做筛选标记   不知各位前辈是否有此类实验经验来敲除目的基因   
实验顺利大概需多少时间能完成
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1楼 2012-06-05 11:03:28
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)
★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 21:29:36
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统
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3楼2012-06-05 14:57:55
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 21:29:42
不知酶基因是什么，选择不好效率太差了。你可以用一些显性的遗传标记啊，比如抗G418的基因作为筛选标记。这样的话，把同源序列克隆到标记上下游，酶切一下，一次就筛选出来。
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2楼2012-06-05 13:41:30
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:03:00
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统
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4楼2012-06-05 14:58:08
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auau96

新虫 (小有名气)
谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路：利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 同时敲掉目的基因
即   左侧同源臂（启动子）+酶的CDS序列+右侧同源臂（终止子）  
由于之前实验室并没有做过敲除 还不知此思路是否可行  
望各位不吝赐教  谢谢
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5楼2012-06-05 15:23:20
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