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auau96

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-07 08:38:28
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达(分泌或细胞表面展示)的前提下,可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时,构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话 ...

谢谢前辈的箴言  敲除实验正在不断进行  准备同时转换思路  改变基因敲除盒片段 可能还得花一段时间才有大进展  
祝工作顺利
11楼2012-06-07 11:03:07
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:02:49
基本不可行...单纯一个酶,很难用水解圈筛选。另一方面,酵母的蛋白表达量不高,也会影响你的筛选.仅供参考..
12楼2012-06-07 12:06:26
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zyly605

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-05 15:23:20
谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路:利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 ...

我也做过酵母菌株的基因敲出,当时使用G418作为筛选标记。但是不太了解你的这种思路,想和你交流下,如果你选用要表达的酶做基因筛选标记,说明这个酶本来酵母是不产生的,并且你每次筛选都得测酶活或蛋白电泳?是这个意思吗
13楼2012-06-07 13:39:40
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zyly605

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:10:02
谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转 ...

可以对构建的重组质粒进行下测序就可以知道是否突变了,我当时是这样的。
14楼2012-06-07 13:42:10
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cxl1078

金虫 (初入文坛)

楼主做得怎么样了?我看你帖子受益匪浅啊,谢谢,祝福啊,希望你早日成功
15楼2012-08-23 15:25:56
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:13:34
用的是纤维素酶基因  但是只用了它的CDS序列  想利用被敲基因ORF上下游做启动子和终止子  想达到及表达标记基因 也替换被敲基因的ORF

可能这样的设计有问题
不知前辈有何高见  请赐教  谢谢...

想问一下,怎样确定这个外源基因在酵母中有活性呢?
姥姥不疼,舅舅不爱
16楼2012-12-04 08:25:31
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-07 08:38:28
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达(分泌或细胞表面展示)的前提下,可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时,构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话 ...

有什么实验方法能确定蛋白有活性呢?
姥姥不疼,舅舅不爱
17楼2012-12-04 08:27:33
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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by caoluoyuan at 2012-06-05 14:57:55
是不是采用Cre/loxP系统?PUG6系统质粒,G418选择标记?
这就是同源重组原理,应该在3-6个月可以搞定,我之前有搞过这个,用的是Cre/loxP系统

请问G418是怎么配置的?是不是很容易失效啊?我筛出来好多假的
18楼2013-04-26 08:48:41
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lyyjackey

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:10:02
谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转 ...

理论上你这左右臂长度已经可以达到敲除的效果了,做敲除的实验吧,感觉运气成分真的很大,有时候一不小心就敲掉了,我目前也是在做酿酒酵母的敲除实验,希望多多交流啊。
19楼2013-05-23 17:04:07
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lyyjackey

新虫 (小有名气)

请问你做的是什么酿酒酵母的敲除,希望进一步交流。
20楼2013-05-23 17:06:31
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