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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间
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auau96

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-07 08:38:28
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达（分泌或细胞表面展示）的前提下，可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时，构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话 ...

谢谢前辈的箴言  敲除实验正在不断进行  准备同时转换思路  改变基因敲除盒片段 可能还得花一段时间才有大进展  
祝工作顺利
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11楼2012-06-07 11:03:07
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-23 18:02:49
基本不可行...单纯一个酶，很难用水解圈筛选。另一方面，酵母的蛋白表达量不高，也会影响你的筛选.仅供参考..
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12楼2012-06-07 12:06:26
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zyly605

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-05 15:23:20
谢谢各位
不是cre/loxp 系统  就用长片段同源重组PCR方法构建基因敲除盒原理进行敲除   
没有选用G418 是因为别人早就做过了一样的课题
基因敲除盒的构建设计思路：利用敲除目的基因的启动子和终止子来表达酶 ...

我也做过酵母菌株的基因敲出，当时使用G418作为筛选标记。但是不太了解你的这种思路，想和你交流下，如果你选用要表达的酶做基因筛选标记，说明这个酶本来酵母是不产生的，并且你每次筛选都得测酶活或蛋白电泳？是这个意思吗
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13楼2012-06-07 13:39:40
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zyly605

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:10:02
谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转 ...

可以对构建的重组质粒进行下测序就可以知道是否突变了，我当时是这样的。
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14楼2012-06-07 13:42:10
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cxl1078

金虫 (初入文坛)
楼主做得怎么样了？我看你帖子受益匪浅啊，谢谢，祝福啊，希望你早日成功
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15楼2012-08-23 15:25:56
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:13:34
用的是纤维素酶基因  但是只用了它的CDS序列  想利用被敲基因ORF上下游做启动子和终止子  想达到及表达标记基因 也替换被敲基因的ORF

可能这样的设计有问题
不知前辈有何高见  请赐教  谢谢...

想问一下，怎样确定这个外源基因在酵母中有活性呢？
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姥姥不疼，舅舅不爱
16楼2012-12-04 08:25:31
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by iaminxanadu at 2012-06-07 08:38:28
纤维素酶基因复杂。保证有活性、且能胞外表达（分泌或细胞表面展示）的前提下，可以用纤维素为唯一碳源筛选。

想在敲除一基因同时，构建纤维素利用的工程菌想法可行。但涉及到很多基础的问题。如果是这样思路的话 ...

有什么实验方法能确定蛋白有活性呢？
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姥姥不疼，舅舅不爱
17楼2012-12-04 08:27:33
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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by caoluoyuan at 2012-06-05 14:57:55
是不是采用Cre／loxP系统？PUG6系统质粒，Ｇ４１８选择标记？
这就是同源重组原理，应该在３－６个月可以搞定，我之前有搞过这个，用的是Cre／loxP系统

请问G418是怎么配置的？是不是很容易失效啊？我筛出来好多假的
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18楼2013-04-26 08:48:41
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by auau96 at 2012-06-06 21:10:02
谢谢   设计用的是纤维素酶透明圈筛选   但是做了好几次转化 结果都整合不上去  标记基因进入细胞内 传代几次就丢了    用透明圈筛选也没有圈圈 得结论是未整合上去 基因没敲掉  

不知是不是以为我把PCR产物做转 ...

理论上你这左右臂长度已经可以达到敲除的效果了，做敲除的实验吧，感觉运气成分真的很大，有时候一不小心就敲掉了，我目前也是在做酿酒酵母的敲除实验，希望多多交流啊。
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19楼2013-05-23 17:04:07
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
请问你做的是什么酿酒酵母的敲除，希望进一步交流。
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20楼2013-05-23 17:06:31
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