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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达蛋白变小
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Pushing2012

金虫 (正式写手)

[求助] 原核表达蛋白变小

本人用原核Rosetta，载体PET30做蛋白原核表达，目的基因992bp，预测蛋白大小41kda，每次诱导表达SDS检测，都出现蛋白变小，与对照相比，在27kda左右出现一个非常明显的带，以及在37kda左右出现一个不是特别明显的带，但仔细看还是能看到，在41kda左右没有新条带产生，求解。 另外，第一次做表达用的是BL21，当时只出现37kda的带，镍柱纯化后 纯化得到的蛋白SDS检测又在41kDa,真让人费解，有高人能帮忙解决和解释下这个问题吗
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1楼 2012-05-28 20:22:29
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-31 09:34:11
是不是41kd的条带太浅，上样浓缩条带富集了所以跑胶才看见。以前我们做Codon plus的时候也是会在27左右出现一个额外的条带，当时的解释是氯霉素抗性蛋白（好像是600bp左右）的条带，不知道对不对
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5楼2012-05-30 22:36:28
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能诱导的时候发生断裂了吧，以前我们实验室的也遇到过类似情况
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2楼2012-05-30 11:00:39
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-30 13:44:24
Pushing2012: 金币+20, ★★★很有帮助 2012-06-01 10:50:56
1.酶活啊，binding啥的如果满足需求了，一般就不折腾了。文献中是不是有类似情况描述。
2.产量是否能够对应上，纯化后的41kDa是否就是原先37kDa的条带，还是看不到的条带的富集。
3.换了菌株，表达条件，破菌条件不同有可能会造成表达中止或断裂，降解，可以设计N，C的his tag用来检测。再换其他的，或者换回去。
4.同一个蛋白，由于结构的不同，在SDS上面是有可能跑出不同大小的。也不排除纯化条件产生复性效果，造成结构恢复正常。虽无明显变复性过程，但是毕竟盐浓度，pH甚至暴漏在空气中时间不同，也不绝对说没用可能吧。
5.既然已经纯化出来了，那做N,C端测序最有保证了
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3楼2012-05-30 11:45:57
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Pushing2012

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by roomofxw at 2012-05-30 11:45:57
1.酶活啊，binding啥的如果满足需求了，一般就不折腾了。文献中是不是有类似情况描述。
2.产量是否能够对应上，纯化后的41kDa是否就是原先37kDa的条带，还是看不到的条带的富集。
3.换了菌株，表达条件，破菌条件 ...

第一次 测了酶活，没活性；现在又做了次 以为是稀有密码子的问题 换了菌株，这次纯化出来蛋白有近70kDa，我都要崩溃了！
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4楼2012-05-30 16:32:14
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