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mche2005

木虫 (正式写手)

7-5-3

MolEPI: 1
应助: 11 (小学生)
金币: 2811.7
散金: 63
红花: 7
帖子: 455
在线: 135.5小时
虫号: 1198543
注册: 2011-02-01
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 在用CTAB法提取曲霉总DNA时，提取很多次没有成功，期望大家多多帮助。

1、PDA培养适当时间（72h），真菌菌丝体9000转离心3min，滤纸吸水。吸除绝大部分水分，否则，含水量过大会严重影响液氮研磨的效率。
或者直接用灭菌的八折纱布进行过滤。
2、研钵（液氮研磨）至粉末。快速研磨，严防液氮溅射。研磨过程中防止样品因为液氮挥发所导致的冻融。
3、加入预热的CTAB700uL，轻柔的颠倒混匀，65℃水浴1h（每隔10min摇一次），室温12000rpm，10min，吸取上清。
4、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm，5min，取上清（500uL）。
5、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm，5min，4℃离心后，取上清液（500uL）。
6、加入-20℃预先冷存异丙醇（2/3体积），-20℃冰箱沉淀1h。12000rpm，10min，4℃离心后取上清。
7、75%乙醇洗涤2次，12000rpm，3min，4℃离心。
8、室温晾干10-15min，加入20-50uL TE溶解。
9、加入RNase A (10 mg/mL) ,37℃保温30 min 以上。
10、取 4u L 电泳。加入1uL Rnase 37摄氏度消化30min，电泳检测结果

结果，提了很多次都没有成功，请问是什么原因？

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1楼2012-05-23 11:23:36

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wsw2t

银虫 (初入文坛)

MolEPI: 1
应助: 1 (幼儿园)
金币: 261.9
散金: 28
帖子: 37
在线: 36.6小时
虫号: 1395930
注册: 2011-09-09
专业: 食品科学基础

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
mche2005: 金币+2, ★★★很有帮助, 你有没有试过如果不加CTAB沉淀剂的情况下，能不能提出来总DNA？ 2012-05-25 10:14:48
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 热心回帖，一起奖励EPI一枚~ 2012-05-26 10:52:51

给你一个我当时提DNA的详细步骤吧，有问题欢迎继续交流吧!
取50 mg 菌丝，加入液氮研磨成粉末状，加入600 µL CTAB 抽提液（2% CTAB，100 mmol Tris-HCl （pH 8.0），20 mmol EDTA，1.4 mol NaCl，pH 8.0，2% β-巯基乙醇）中，65℃温浴1 h。在抽提液中加入650 µL 氯仿-异戊醇（24﹕1），混匀后离心取上清，同法再抽提1遍。在上清中加入1 mL CTAB 沉淀液[1% CTAB，50 mmol Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol EDTA]，室温沉淀30 min，12 000 r/min 离心4 min，倒上清，将沉淀溶于 400 µL 高盐 TE[10 mmol Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mmol EDTA，1 mol NaCl]，37℃30 min 溶解。加入两倍体积-20℃无水乙醇在20℃沉淀2 h，12 000 r/min 离心5 min，风干后加入80 µL TE。取4 µL DNA 在1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，剩余DNA-20℃保存备用.