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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 在用CTAB法提取曲霉总DNA时，提取很多次没有成功，期望大家多多帮助。
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mche2005

木虫 (正式写手)

7-5-3

[求助] 在用CTAB法提取曲霉总DNA时，提取很多次没有成功，期望大家多多帮助。

1、PDA培养适当时间（72h），真菌菌丝体9000转离心3min，滤纸吸水。吸除绝大部分水分，否则，含水量过大会严重影响液氮研磨的效率。
或者直接用灭菌的八折纱布进行过滤。
2、研钵（液氮研磨）至粉末。快速研磨，严防液氮溅射。研磨过程中防止样品因为液氮挥发所导致的冻融。
3、加入预热的CTAB700uL，轻柔的颠倒混匀，65℃水浴1h（每隔10min摇一次），室温12000rpm，10min，吸取上清。
4、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm，5min，取上清（500uL）。
5、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），12000rpm，5min，4℃离心后，取上清液（500uL）。
6、加入-20℃预先冷存异丙醇（2/3体积），-20℃冰箱沉淀1h。12000rpm，10min，4℃离心后取上清。
7、75%乙醇洗涤2次，12000rpm，3min，4℃离心。
8、室温晾干10-15min，加入20-50uL TE溶解。
9、加入RNase A (10 mg/mL) ,37℃保温30 min 以上。
10、取 4u L 电泳。加入1uL Rnase 37摄氏度消化30min，电泳检测结果


结果，提了很多次都没有成功，请问是什么原因？
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1楼 2012-05-23 11:23:36
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cxfans

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-23 14:06:33
离心怎么是常温呢？4度离心的。异丙醇沉淀时候我们是等体积。ctab是2%的吧，试一下3%的，再加一些pvp 1%和 巯基乙醇 1%，我就是这样提真菌的dna 很好用。第二次抽提 用氯仿。
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2楼2012-05-23 11:32:52
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mche2005: 金币+2, ★★★很有帮助, 感谢您的帮助 2012-05-23 12:25:23
液氮研磨时研磨得充分一些，CTAB裂解时间再加长一些试试。
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
3楼2012-05-23 11:56:35
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植物园园长

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用试剂盒不更好，方便又好用，
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在路上～～Marketing!
4楼2012-05-23 16:37:40
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-23 21:48:07
裂解液具体的配方是？
异丙醇有0.7倍体积足已。
提DNA室温离心足已。
以上问题都不足已导致提取不出来，不知是否有可见的沉淀？是否有测OD？电泳结果是完全无条带还是怎样？
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伟大航线....
5楼2012-05-23 17:14:09
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liushuyan

禁虫 (知名作家)
★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-23 21:48:20
本帖内容被屏蔽
6楼2012-05-23 17:24:32
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elbo

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励交流经验！ 2012-05-23 21:48:32
第三步 水浴后离心12000 有点高吧，我们提肠道DNA，都是5000r。
第六步， 0.6倍体积足矣， -80度 15min，效果不错，你可以试试，这步我们一般都是离心弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，你怎么是取上清呢，上清里面肯定没有DNA沉淀啊
最好有个电泳图
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7楼2012-05-23 21:23:02
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-23 22:31:29
mche2005: 金币+3, ★★★很有帮助, 感谢应助 2012-05-24 09:16:54
菌丝体是不是不够啊

裂解时间也可以延长一些。。

另外，其实蛮推荐用真菌试剂盒的，效率非常高，也不是很贵
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
8楼2012-05-23 22:29:25
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mche2005

木虫 (正式写手)

7-5-3
内容已删除
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9楼2012-05-24 09:16:34
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
mche2005: 金币+3, ★★★很有帮助, 我很早都想用这款试剂盒。谢谢 2012-05-24 11:18:13
内容已删除
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
10楼2012-05-24 10:39:55
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