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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：重组质粒酶切问题！请大家帮我解决一下，急！
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M110899

金虫 (正式写手)

[求助] 求助：重组质粒酶切问题！请大家帮我解决一下，急！

PET-32a原核表达载体与IL-10目的片段连接后，大提质粒进行酶切鉴定。
上图从左到右依次为：1kb的marker（宝生物），重组质粒，BamHI单酶切，BanHI+HindIII双酶切，DL-1000的marker（宝生物）。
我的目的片段大小为537bp，原核载体大小5.9kb。有几个问题想请教大家：
（1）为什么1kb的marker没能跑开（我做的是1%的胶）？
（2）为什么重组质粒会出现两条带，且最下面的很亮（是不是我质粒提取的问题）？
（3）双酶切怎么没看到目的片段？（这个图片肯定是看不到的，当时拍照的时候师兄说隐隐约约能看到一点点，我的酶切体系是20微升，是不是因为体系太小，切下的目的片度浓度不高所以才看不到？）
（4）上面这个图能不能排除载体与片段没有连上的可能性？
麻烦大家帮我解决一下，谢谢！

PET-IL10重组质粒酶切结果
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1楼 2012-05-05 09:58:20
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-05 13:39:21
不能，你这个结果不能说明问题，因为你连Marker都没跑好，标准没有可比性
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-05 13:20:11
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M110899

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-05 13:20:11:
不能，你这个结果不能说明问题，因为你连Marker都没跑好，标准没有可比性

那能不能麻烦帮我分析一下上面的问题呢?
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3楼2012-05-05 14:56:04
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，分析的很全面哦 2012-05-10 13:47:21
marker没跑开：你胶用的时候是不是彻底凝固了？加样时是否把胶戳漏了？
现在也不能排除你是不是连接上，要不你可以pcr试一下。还有我想问一下你质粒有蓝白筛选吗？
你质粒量提的量少，尽量提的使你的质粒量多一些，多一些，你切完500bp的带才能看的更清楚。
你酶切的时候最好加RNAase，这样500bp多的带能看的清楚些，要不有可能被RNA覆盖。
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未来不是梦
4楼2012-05-05 15:25:42
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M110899

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-05 15:25:42:
marker没跑开：你胶用的时候是不是彻底凝固了？加样时是否把胶戳漏了？
现在也不能排除你是不是连接上，要不你可以pcr试一下。还有我想问一下你质粒有蓝白筛选吗？
你质粒量提的量少，尽量提的使你的质粒量多一 ...

1、我做的是1%的胶，大概半小时以后用的，难道不是等彻底凝固后用吗？而且我确定没有戳破。
2、我当时挑菌的时候没有蓝白斑筛选，就随机挑了12个单菌落，然后菌液PCR鉴定，均为阳性（有可能是假阳性）。
3、你说我的质粒提的有点少，是什么意思呢？我用的是20微升的酶切体系，其中质粒的量大约1ng，切出来看不清目的片段，我是不是应该扩大酶切体系？
4、加RNAase是在提完质粒后加吗？
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5楼2012-05-09 20:09:54
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
先把胶做好了再说吧!
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总有一天我要修改用户名。
6楼2012-05-09 23:16:59
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张宏宇123

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by M110899 at 2012-05-09 20:09:54:
1、我做的是1%的胶，大概半小时以后用的，难道不是等彻底凝固后用吗？而且我确定没有戳破。
2、我当时挑菌的时候没有蓝白斑筛选，就随机挑了12个单菌落，然后菌液PCR鉴定，均为阳性（有可能是假阳性）。
3、你 ...

你提质粒量少，做酶切，小片段就容易看不出来，加RNase是在酶切体系里加，否则小片段容易被RNA覆盖住。
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未来不是梦
7楼2012-05-10 10:05:27
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知来者之可追

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
M110899: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-03-25 08:32:58
提质粒时多收集几次菌体 用洗脱液少点 质粒浓度就高了啊 质粒应该有三条带 按中间那条与marker比对大小
还有延长双酶切时间 你可以试试切24h，我那个切了一天效果比切3h好多了
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8楼2013-03-24 21:57:12
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