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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光pcr标准曲线问题
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yangzhengnan

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光pcr标准曲线问题

今天做了一条标准曲线，很奇怪，目的基因模板按2倍稀释，但是ct值却相差很小，复孔之间的差别很大，但内参复孔间的差别很小，不知各位大侠可不可以给点建议呢？到底是哪里出了问题？
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1楼 2012-04-05 17:33:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我做了一年多的荧光定量PCR，所以能够给你些建议：1 稀释，你大概是用灭菌的去离子水稀释的吧，一般的用水稀释，DNA并不能很好的均匀分散在水里，尤其是多次梯度稀释，模版稀释10倍，Ct值大约相差3.3，稀释2倍，那么Ct值本身相差就很小，应该是相差1，做标准曲线，模板应该10倍梯度稀释，当多次稀释的话一般就不能用水了，可以买TaKaRa的EASY dilution进行稀释，每次稀释后都要用枪来回吸打数十次，再稍微离心混匀，这样才能保证是梯度稀释，如果没有EASY Dilution 稀释液，配置pH8.0的TE缓冲液，一般稀释到pg级的应该是没有问题的，都很准确，但是到fg级也就是说模板数在几十拷贝或几个拷贝时就不怎么准确了。2 PCR的反应体系的体积应该大一些，至少是10uL，建议是20uL，这样误差就会减少的，当然你加模板的体积一定要准确，加样的技能一定要熟练。
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8楼2012-06-24 12:35:41
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 2倍确实太小 2012-04-05 18:43:54
有图有真相
复孔指的技术重复吗？如果是的，注意加样误差，甩出来一丁点都会影响Ct值，同样注意机子可能有加热不匀的情况
为何做2倍稀释呢，太小了吧，稀释10倍看看吧
个人经验，若有说错，高手指点哦
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-05 17:38:21
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跟我遇到的问题一样，多做几次吧。有可能是基因丰度太低，所以你稀释的不均匀可能是主要原因。因为内参的丰度高，所以你操作的影响不大，但是目的基因就不一样了
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3楼2012-04-05 18:35:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
理想情况下扩增效率为100％，产物按2的N次方递增，如果模板量相差8倍，Ct值也就相差3而已（2^3=8），所以你的2倍梯度，Ct值也就相差1左右。一般做标准曲线取10倍梯度比较常见哦。
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4楼2012-04-05 18:45:51
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先要确定你的程序跑出来的条带比较单一，特异性好，不然定量结果没有意义；
其次标线一般做10倍倍比稀释，一定要充分震荡混匀，取样到下一个梯度时要用枪头尖贴着管壁吸取，这样枪头上沾的会比较少；
最后加样的时候一定要把枪头插入液面以下，在液体和空气接触面稍微下一点就可以。
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6楼2012-04-06 14:46:20
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普通回帖

yangzhengnan

新虫 (初入文坛)
是不是稀释倍数少，复孔之间差别又大，这样就影响扩增效率呢，今天又做了一次，还是超过120%，请问有什么办法呢？可不可以升高退火温度？谢谢大家的帮忙！请教下孙启亮，你的结果做出来了么，问题是怎么解决的呢？
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5楼2012-04-06 13:41:19
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华烎

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

本人也有类似现象，一直怀疑标线稀释有问题，是不是手法不当导致？！谢谢了。
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坚持就是胜利
7楼2012-06-24 11:20:40
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by beautybanana at 2012-06-24 12:35:41
我做了一年多的荧光定量PCR，所以能够给你些建议：1 稀释，你大概是用灭菌的去离子水稀释的吧，一般的用水稀释，DNA并不能很好的均匀分散在水里，尤其是多次梯度稀释，模版稀释10倍，Ct值大约相差3.3，稀释2倍，那么 ...

大神，我们现在要检测的东西就是在fg级啊，400fg往下那几个点，老是重复性不好，唉，悲剧，莫非低拷贝时没有好的解决办法吗？
做的好的时候线性倒是蛮好的
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9楼2013-09-22 13:20:36
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-22 21:27:56
引用回帖:
9楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-09-22 13:20:36
大神，我们现在要检测的东西就是在fg级啊，400fg往下那几个点，老是重复性不好，唉，悲剧，莫非低拷贝时没有好的解决办法吗？
做的好的时候线性倒是蛮好的...

你要买商业用的稀释液+良好的操作应该可以做到很好的重复性的.
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10楼2013-09-22 16:26:18
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