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yangzhengnan新虫 (初入文坛)
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荧光pcr标准曲线问题
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| 今天做了一条标准曲线，很奇怪，目的基因模板按2倍稀释，但是ct值却相差很小，复孔之间的差别很大，但内参复孔间的差别很小，不知各位大侠可不可以给点建议呢？到底是哪里出了问题？ |
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 实验 |
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【答案】应助回帖
| 我做了一年多的荧光定量PCR，所以能够给你些建议：1 稀释，你大概是用灭菌的去离子水稀释的吧，一般的用水稀释，DNA并不能很好的均匀分散在水里，尤其是多次梯度稀释，模版稀释10倍，Ct值大约相差3.3，稀释2倍，那么Ct值本身相差就很小，应该是相差1，做标准曲线，模板应该10倍梯度稀释，当多次稀释的话一般就不能用水了，可以买TaKaRa的EASY dilution进行稀释，每次稀释后都要用枪来回吸打数十次，再稍微离心混匀，这样才能保证是梯度稀释，如果没有EASY Dilution 稀释液，配置pH8.0的TE缓冲液，一般稀释到pg级的应该是没有问题的，都很准确，但是到fg级也就是说模板数在几十拷贝或几个拷贝时就不怎么准确了。2 PCR的反应体系的体积应该大一些，至少是10uL，建议是20uL，这样误差就会减少的，当然你加模板的体积一定要准确，加样的技能一定要熟练。 |
8楼2012-06-24 12:35:41
atlanticwi
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