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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光pcr标准曲线问题
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yangzhengnan

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光pcr标准曲线问题

今天做了一条标准曲线，很奇怪，目的基因模板按2倍稀释，但是ct值却相差很小，复孔之间的差别很大，但内参复孔间的差别很小，不知各位大侠可不可以给点建议呢？到底是哪里出了问题？
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1楼 2012-04-05 17:33:51
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先要确定你的程序跑出来的条带比较单一，特异性好，不然定量结果没有意义；
其次标线一般做10倍倍比稀释，一定要充分震荡混匀，取样到下一个梯度时要用枪头尖贴着管壁吸取，这样枪头上沾的会比较少；
最后加样的时候一定要把枪头插入液面以下，在液体和空气接触面稍微下一点就可以。
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6楼2012-04-06 14:46:20
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 2倍确实太小 2012-04-05 18:43:54
有图有真相
复孔指的技术重复吗？如果是的，注意加样误差，甩出来一丁点都会影响Ct值，同样注意机子可能有加热不匀的情况
为何做2倍稀释呢，太小了吧，稀释10倍看看吧
个人经验，若有说错，高手指点哦
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-05 17:38:21
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跟我遇到的问题一样，多做几次吧。有可能是基因丰度太低，所以你稀释的不均匀可能是主要原因。因为内参的丰度高，所以你操作的影响不大，但是目的基因就不一样了
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3楼2012-04-05 18:35:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
理想情况下扩增效率为100％，产物按2的N次方递增，如果模板量相差8倍，Ct值也就相差3而已（2^3=8），所以你的2倍梯度，Ct值也就相差1左右。一般做标准曲线取10倍梯度比较常见哦。
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4楼2012-04-05 18:45:51
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