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克隆细菌未知基因
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各位虫友，你们好！ 如果你们在细菌中发现了一种酶，你们都是怎么克隆它的基因的呢？本人现在就碰到了这个问题，不知接下来该怎么做，请求各位的帮助。 先介绍一下背景：实验室筛选到一株菌，做16s rDNA序列鉴定，结果是芽孢杆菌属；从这株菌中分离纯化出一种酶，做蛋白质N端测序，NCBI比对未发现相同或相似的蛋白。 问题是：这株菌的基因组序列未知，现在想知道这个酶的氨基酸序列或编码这个酶的基因序列，应该怎么做呢？谁能给我一些详细的、可行的答案呢？ 真不知道NCBI里面这么多细菌酶的序列，它们都是怎么由未知变已知的呢？ |
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6楼2012-03-19 09:11:05
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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1、16s rDNA序列鉴定是芽孢杆菌属，可以查NCBI已报道的芽孢杆菌基因组，从基因组中找到一些编码你这个酶的基因，然后分析其同源性或保守序列，如果有保守序列，可以利用保守序列去设计引物，PCR获得你的酶的部分编码序列，然后利用染色体步移获得全长基因。 2、已经分离纯化该酶，并做了N端测序，可以利用N端序列设计一条兼并引物，但还缺少一条引物，你可以再做下肽谱，从肽谱的序列中设计另外一个引物，PCR获得你的酶的N端到中间的编码序列，然后利用染色体步移获得3“端序列，获得全长基因。 |
2楼2012-03-16 16:01:52
sunwei57
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5