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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光PCR中，荧光阀值的问题
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liwanghua251

金虫 (小有名气)

[交流] 荧光PCR中，荧光阀值的问题

我做相对定量，什么时候需要手动设置阀值？
做了两板PCR，怎么才能一起分析相对定量。例如，一个板子上是0h,12h,24h,36h。另一板上是0h,48h,60h,72h.想把他们同一起来比较，得出不同时间段的表达差异。
是否需要把两板中的0h,的Ct值调成一致。
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1楼2012-03-14 09:17:49
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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liwanghua251(金币+1): 2012-03-15 09:05:59
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-03-15 09:58:29
不用调阈值的，调了也没意义。阈值虽然能影响CT值，但是不能影响Ct值的差异（前提是阈值设置在合理范围）。
你两个板的不同时间点的样品分别和同一个板上的0h比较，两个板的结果可以放在一起，不过严谨的做法应该是所有样品都在同一个板上跑。
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2楼2012-03-14 22:43:50
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liwanghua251

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-14 22:43:50:
不用调阈值的，调了也没意义。阈值虽然能影响CT值，但是不能影响Ct值的差异（前提是阈值设置在合理范围）。
你两个板的不同时间点的样品分别和同一个板上的0h比较，两个板的结果可以放在一起，不过严谨的做法应该 ...

我也知道严谨的做法，但是实在是没法放在一起。是不是说一般的阀值都不用改，按照机器给的就可以了吗？
还有个问题就是，阴性对照的作用是什么？我做的阴性对照也有峰怎么回事？
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3楼2012-03-15 09:05:48
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
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liwanghua251: 金币+1 2012-03-16 12:21:05
引用回帖:
3楼: Originally posted by liwanghua251 at 2012-03-15 09:05:48:
我也知道严谨的做法，但是实在是没法放在一起。是不是说一般的阀值都不用改，按照机器给的就可以了吗？
还有个问题就是，阴性对照的作用是什么？我做的阴性对照也有峰怎么回事？

一般做 荧光定量的话都不用调阀值的，按机器默认的就行。阴性对照有峰说明你的体系可能有污染
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4楼2012-03-15 17:49:10
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liwanghua251

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-15 17:49:10:
一般做 荧光定量的话都不用调阀值的，按机器默认的就行。阴性对照有峰说明你的体系可能有污染

可能不可能是引物二聚体。
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5楼2012-03-16 12:20:24
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liwanghua251

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-15 17:49:10:
一般做 荧光定量的话都不用调阀值的，按机器默认的就行。阴性对照有峰说明你的体系可能有污染

那为啥还要设手动阀值呢？
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6楼2012-03-16 12:21:01
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andyzhengwp

金虫 (小有名气)
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liwanghua251: 金币+1 2012-03-16 18:14:10
阈值是不用调的，机器自动生成，一般只有一个峰，如果出现两个峰有可能是引物二聚体，或者是加样出现了问题
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7楼2012-03-16 12:43:38
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
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liwanghua251: 金币+1 2012-03-16 18:12:41
引用回帖:
5楼: Originally posted by liwanghua251 at 2012-03-16 12:20:24:
可能不可能是引物二聚体。

阴性对照没有模板，只有引物，怎么会有带？所以不会是引物二聚体，应该是你的体系污染。如果你的样品扩增过程 中出现了另外的峰，则要么是非特异性扩增，要么是引物二聚体
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8楼2012-03-16 16:47:00
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liwanghua251

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-16 16:47:00:
阴性对照没有模板，只有引物，怎么会有带？所以不会是引物二聚体，应该是你的体系污染。如果你的样品扩增过程 中出现了另外的峰，则要么是非特异性扩增，要么是引物二聚体

谢谢，引物二聚体和模板有关系吗？能不能说明是引物设计的事。我样品是单一峰
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9楼2012-03-16 18:12:34
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liwanghua251

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by andyzhengwp at 2012-03-16 12:43:38:
阈值是不用调的，机器自动生成，一般只有一个峰，如果出现两个峰有可能是引物二聚体，或者是加样出现了问题

那为啥机器还要设手动阀值呢？
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10楼2012-03-16 18:14:07
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励 2012-03-17 09:33:32
liwanghua251: 回帖置顶 2012-03-17 15:38:08
liwanghua251: 金币+5 2012-03-17 15:38:24
只要在指数期就可以，手动自动都行。要矫正不同板的数据有两种方法。一种就是设定一个共有样品为calibrator。另一种就是将数据结果即ct扣除整板数据的平均ct，但是这要求你设置板的时候是随机分配样品的。
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11楼2012-03-17 00:13:21
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liwanghua251

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by shaquila at 2012-03-17 00:13:21:
只要在指数期就可以，手动自动都行。要矫正不同板的数据有两种方法。一种就是设定一个共有样品为calibrator。另一种就是将数据结果即ct扣除整板数据的平均ct，但是这要求你设置板的时候是随机分配样品的。

不是很懂。是否是根据共有样品的样本来调还是怎么着？因为共有样本Ct值一样的很少哈。就说我那个实验吧，怎么合在一起，谢谢
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12楼2012-03-17 15:42:55
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