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Zedone

木虫 (正式写手)


[交流] 关于xba I单酶切后的TA连接

由于Xba I酶切后会产生T端,本人最近用Xba I对质粒载体进行单酶切,然后再将目的片段通过与其进行TA连接。在整个过程中,从酶切,胶回收,每一步都做了验证。最后用takara T4 ligase进行16°C过夜连接反应。最终转化后却没有得到转化子。现已验证感受态没有问题。请问有出现过问题的虫友么?此外,在连接时,我另外尝试4°C连接,均未果。
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
连的上才是奇迹了!你确定你弄懂 粘性末端的结构了么!只有识别序列是5位,第三位为T且切点在T后处的内切酶才可能切出带单个T的口来~如图
5-NNT   NN-3
3-NN   TNN-5
~我查了下,没有发现~~~~~~~
2楼2012-03-06 20:58:56
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+3): Good! 2012-03-07 12:21:36
补充~下面应该是3-NN  ANN-5~~所以即使有也不能连上的~~~~

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3楼2012-03-06 21:05:56
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panda73

金虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
理论上,XbaI酶切的载体是不能进行TA克隆的,建议你好好研究一下TA克隆的原理及限制性内切酶的原理
4楼2012-03-06 21:43:47
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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
wanhscn(金币+2): Good! 2012-03-07 14:27:22
楼主,要先看懂基因工程原理的教材。只有两端都突出一个T才能与PCR产物连接的。你先搞清楚什么是T载体,很明显XbaI产生的末端T CTAGA不可能连得上PCR产物的。用XcmI可以做T载体。
5楼2012-03-07 11:50:53
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
差点被楼主忽悠了。
6楼2012-03-07 16:41:23
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hyacinth326

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
哈哈,这个问题。。。楼主明显带点小聪明啊
7楼2012-03-07 20:25:18
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Zedone

木虫 (正式写手)


送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by Petter_JDW at 2012-03-06 21:05:56:
补充~下面应该是3-NN  ANN-5~~所以即使有也不能连上的~~~~

原来是这样啊。我当时是真的没仔细看xbaI。谢谢你。
8楼2012-03-08 18:57:00
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