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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于脱盐柱的问题
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 关于脱盐柱的问题

本人用 Sephadex G-25 Medium柱子脱盐，出来两个蛋白峰是怎么回事？所有的蛋白不是应该一起下来吗？所谓“盐峰”是什么？我要的产物在第一个峰，第二个峰活性很低。另外，请问脱盐的时候，用什么尺寸的柱子为好？是细长一些的还是粗短一些的？26X20cm柱子怎么样？我样品一般有十几毫升。
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1楼 2012-03-05 15:46:49
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
这个问题似乎我在哪个帖子里回答过了
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2012-03-05 22:37:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
如果是用紫外吸收来测定，那么曲线是可能会存在2个峰的，很正常。
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9楼2012-03-05 22:48:26
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
我自己都找不到了，就在这里说吧，
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14楼2012-03-09 03:05:13
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

看天(BioEPI+1): 感谢热心交流 2012-03-09 16:21:24
引用回帖:
14楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-09 03:05:13:
我自己都找不到了，就在这里说吧，

注意下面图片左上角的注释，cond=电导，cond%=电导率，这两个是表示盐的，A280是用于测定蛋白质的。每两条竖直的红线是每一次脱盐洗脱的循环，那一次我一共做了很多次，用的是AKTA纯化仪，层析柱是GE的desalting，26/10，流速快10ml/min。

我用的样品是真菌固体培养物用超纯水浸泡，离心得到的粗酶液脱盐。从A280曲线来看，盐峰之后再次升高，说明粗酶液里也有很多分子量比蛋白质小的能引起A280吸收的物质。由于A280的原理是测定分子结构中有共轭双键构成大Ω键的物质，所以某些存在此结构的色素也能引起光吸收，而这部分洗脱液确实是有颜色的，所以可能是分子量较小的色素和其它非蛋白质的小分子物质，而不是蛋白质。因为脱盐柱是分子筛，分子尺寸大的蛋白质应该在盐之前就被洗脱出来，存在于第一个峰中。(怎么说我的图是广告呢，再发一次又能发上来的怎么可能是嘛)
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15楼2012-03-09 03:14:19
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
引用回帖:
17楼: Originally posted by baicai1487 at 2013-11-18 14:05:20
您好！我脱盐的时候也出现了您这种情况，我把盐峰之前的峰和盐峰下面的峰都收集好了，做了电泳分析，发现盐峰下面的峰有蛋白的，很疑惑...

我也跑过，发现是没有的，因为时间比较久，图片已经没有了，但是对于我的酶来说，确实是全在第一个峰，也就是盐峰之前出来。我纯化了不同菌株来源的4个酶，都是这个情况，只是后面的3个酶测定了酶活力，确认了之后就没有跑胶，也没有图片给你看。建议你再规范地试一次，再作分析。我实在想不出为什么有的蛋白质会在盐峰之后出来。
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18楼2013-11-18 14:43:58
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生物大分子降解酶
引用回帖:
19楼: Originally posted by baicai1487 at 2013-11-18 16:39:37
高手，我能否问个问题，就是除完盐后的蛋白还稳定吗？就是蛋白水液了...

对于我的四个酶来说，稳定。
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20楼2013-11-18 17:13:54
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引用回帖:
21楼: Originally posted by baicai1487 at 2013-11-18 17:39:56
那用水来透析的效果不是一样的吗？我今天把水透析的过了道G25，没有盐峰，除盐效果挺好的。但是用水透析有沉淀，我用PBS透析之后没沉淀，但是透析后的纯度不好算，因为蛋白里有PBS，结果纯度只有40%。用水透析有78 ...

那你的蛋白质纯度是怎么算的？你之前说脱盐，现在说透析，到底是？？？
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22楼2013-11-18 19:46:43
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23楼: Originally posted by baicai1487 at 2013-11-21 08:42:52
透析液冻干成蛋白粉里含有蛋白的量，透析也是可以除盐的，我们老师叫我还得除小分子，所以我就得再过一道G25...

你冻干之前有没有确认蛋白质是单条带？还是说你的蛋白质溶液是含有很多种蛋白质的？
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24楼2013-11-21 15:23:23
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生物大分子降解酶
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25楼: Originally posted by baicai1487 at 2013-11-21 20:27:48
是总蛋白...

这我就不理解了，既然是总蛋白质，含有多种多样的蛋白质，或许就真有的蛋白质会损失掉。而且，如果你提取总蛋白质的方法造成蛋白质变性，那么结果就更难说了。如果有的蛋白质只保留一级结构，那就很可能溶解性很差，而且被脱盐柱的凝胶网络截住，又或者被超滤管的网络截住，损失就是必然了。
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26楼2013-11-21 21:33:33
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27楼: Originally posted by baicai1487 at 2013-11-22 18:20:32
嗯，我的蛋白损失我已经预料到了，现在我又测到里面含糖了，有百分之7.6%，可能是糖蛋白了，所以我总蛋白的纯度要达到百分之九十五太难了...

有糖蛋白是很正常的，但是如果把糖去除会影响蛋白质的活性。
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28楼2013-11-22 20:00:55
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