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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 关于脱盐柱的问题

本人用 Sephadex G-25 Medium柱子脱盐,出来两个蛋白峰是怎么回事?所有的蛋白不是应该一起下来吗?所谓“盐峰”是什么?我要的产物在第一个峰,第二个峰活性很低。另外,请问脱盐的时候,用什么尺寸的柱子为好?是细长一些的还是粗短一些的?26X20cm柱子怎么样?我样品一般有十几毫升。
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

看天(BioEPI+1): 感谢热心交流 2012-03-09 16:21:24
引用回帖:
14楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-09 03:05:13:
我自己都找不到了,就在这里说吧,

注意下面图片左上角的注释,cond=电导,cond%=电导率,这两个是表示盐的,A280是用于测定蛋白质的。每两条竖直的红线是每一次脱盐洗脱的循环,那一次我一共做了很多次,用的是AKTA纯化仪,层析柱是GE的desalting,26/10,流速快10ml/min。

我用的样品是真菌固体培养物用超纯水浸泡,离心得到的粗酶液脱盐。从A280曲线来看,盐峰之后再次升高,说明粗酶液里也有很多分子量比蛋白质小的能引起A280吸收的物质。由于A280的原理是测定分子结构中有共轭双键构成大Ω键的物质,所以某些存在此结构的色素也能引起光吸收,而这部分洗脱液确实是有颜色的,所以可能是分子量较小的色素和其它非蛋白质的小分子物质,而不是蛋白质。因为脱盐柱是分子筛,分子尺寸大的蛋白质应该在盐之前就被洗脱出来,存在于第一个峰中。(怎么说我的图是广告呢,再发一次又能发上来的怎么可能是嘛)





流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2012-03-09 03:14:19
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baodongq

禁虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+3): 很专业! 2012-03-05 18:26:14
amq7392(金币+2): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-08 09:54:19
本帖内容被屏蔽

2楼2012-03-05 16:10:36
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baodongq

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

3楼2012-03-05 16:11:28
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
: Originally posted by baodongq at 2012-03-05 16:10:36:
当采用凝胶过滤层析进行拖延的时候,你所用的缓冲液、柱子的长短和上样量对你的脱盐效果会有很大的影响。凝胶柱最好选择细长一点的(26X60),样品量不要高于10%且浓度要高点。
你在脱盐的时候出现的两个峰,可能 ...

谢谢你!我的样品缓冲液是磷酸缓冲液,洗脱缓冲液用的Tris-HCl。缓冲液在280nm应该没有吸收的呀。
4楼2012-03-05 16:19:10
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