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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于脱盐柱的问题
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本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

amq7392

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 关于脱盐柱的问题

本人用 Sephadex G-25 Medium柱子脱盐，出来两个蛋白峰是怎么回事？所有的蛋白不是应该一起下来吗？所谓“盐峰”是什么？我要的产物在第一个峰，第二个峰活性很低。另外，请问脱盐的时候，用什么尺寸的柱子为好？是细长一些的还是粗短一些的？26X20cm柱子怎么样？我样品一般有十几毫升。
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1楼 2012-03-05 15:46:49
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回帖置顶 ( 共有1个 )

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

看天(BioEPI+1): 感谢热心交流 2012-03-09 16:21:24
引用回帖:
14楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-03-09 03:05:13:
我自己都找不到了，就在这里说吧，

注意下面图片左上角的注释，cond=电导，cond%=电导率，这两个是表示盐的，A280是用于测定蛋白质的。每两条竖直的红线是每一次脱盐洗脱的循环，那一次我一共做了很多次，用的是AKTA纯化仪，层析柱是GE的desalting，26/10，流速快10ml/min。

我用的样品是真菌固体培养物用超纯水浸泡，离心得到的粗酶液脱盐。从A280曲线来看，盐峰之后再次升高，说明粗酶液里也有很多分子量比蛋白质小的能引起A280吸收的物质。由于A280的原理是测定分子结构中有共轭双键构成大Ω键的物质，所以某些存在此结构的色素也能引起光吸收，而这部分洗脱液确实是有颜色的，所以可能是分子量较小的色素和其它非蛋白质的小分子物质，而不是蛋白质。因为脱盐柱是分子筛，分子尺寸大的蛋白质应该在盐之前就被洗脱出来，存在于第一个峰中。(怎么说我的图是广告呢，再发一次又能发上来的怎么可能是嘛)
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
15楼2012-03-09 03:14:19
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普通回帖

baodongq

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+3): 很专业！ 2012-03-05 18:26:14
amq7392(金币+2): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-08 09:54:19
本帖内容被屏蔽
2楼2012-03-05 16:10:36
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baodongq

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
3楼2012-03-05 16:11:28
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by baodongq at 2012-03-05 16:10:36:
当采用凝胶过滤层析进行拖延的时候，你所用的缓冲液、柱子的长短和上样量对你的脱盐效果会有很大的影响。凝胶柱最好选择细长一点的（26X60），样品量不要高于10%且浓度要高点。
你在脱盐的时候出现的两个峰，可能 ...

谢谢你！我的样品缓冲液是磷酸缓冲液，洗脱缓冲液用的Tris-HCl。缓冲液在280nm应该没有吸收的呀。
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4楼2012-03-05 16:19:10
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啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392(金币+2): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-08 09:54:43
第二个峰可能是降解的蛋白。样品是不是有点多，会影响分辨率。盐峰应该是指的电导吧。
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5楼2012-03-05 16:31:39
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baodongq

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2012-03-05 16:32:35
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392(金币+2): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-08 09:55:02
脱盐柱子越长越好，这样的话分子量分的很开了。
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7楼2012-03-05 17:51:42
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
这个问题似乎我在哪个帖子里回答过了
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8楼2012-03-05 22:37:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
如果是用紫外吸收来测定，那么曲线是可能会存在2个峰的，很正常。
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9楼2012-03-05 22:48:26
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392(金币+2): ★★★很有帮助 谢谢 2012-03-08 09:55:30
用GE的desalting柱啊，26/10的，流速快基本能走7-8ml/min，两个峰的话前面一个肯定是目的蛋白，后面是盐峰或者buffer里的成分，带点蛋白是正常的。
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10楼2012-03-06 09:19:25
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