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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] 大家帮忙看看我的蛋白电泳有目的带吗 已有1人参与

图中的A1-A6和B1-B6是两个平行组分别诱导1、2、3、4、5、6h,我的蛋白约40kD左右
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无善无恶心之体
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

补充:::: 图中C代表未用IPTG诱导,P为未导入目的基因的空载体/菌诱导表达。我的体系是pET28a/BL21(DH5)。
无善无恶心之体
2楼2012-02-17 09:53:56
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karin

木虫 (小有名气)

小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:49:02
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-17 09:53:56:
补充:::: 图中C代表未用IPTG诱导,P为未导入目的基因的空载体/菌诱导表达。我的体系是pET28a/BL21(DH5)。

从电泳图看好像没有目的条带。不过pET-28a是带组氨酸标签的,也就是说你表达的蛋白两端都带一段组氨酸,你可以用组氨酸特异抗体做个Western杂交,真正表不表达就知道了。
坚持就是胜利
3楼2012-02-17 10:17:58
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:48:45
zhiqiang5070(金币+3): 有帮助 2012-02-20 15:30:07
按说pET28a的表达产物是单一的,为什么你的图上面有这么多的条带啊?这些条带是培养基里面的蛋白么?建议你用TB培养试试,还有就是不要单纯的用IPTG诱导,适量添加些乳糖。你的样品条带一样的,没有目的条带出现。
4楼2012-02-17 13:10:20
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by shicaozhu at 2012-02-17 13:10:20:
按说pET28a的表达产物是单一的,为什么你的图上面有这么多的条带啊?这些条带是培养基里面的蛋白么?建议你用TB培养试试,还有就是不要单纯的用IPTG诱导,适量添加些乳糖。你的样品条带一样的,没有目的条带出现。

大肠杆菌自身会表达很多的蛋白的啊
无善无恶心之体
5楼2012-02-17 14:01:39
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qjy_134

铜虫 (小有名气)


小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-18 08:14:44
要不就是没有高表达,要不就是你没做好,建议你加一个有高表达的作为阳性对照,诱导3个小时就可以很清楚看到是否高表达,关键是你要控制好诱导条件,在OD多少的时候诱导
6楼2012-02-17 17:49:35
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-17 14:01:39:
大肠杆菌自身会表达很多的蛋白的啊

我用这个质粒做表达的时候,诱导时OD一般为1.0左右,然后加入诱导剂,12,24小时的产物都是单一的,只有36小时后,有比较淡的杂带出现,应该是细胞裂解的碎片。不过我的发酵培养基是TB,你的是什么?
7楼2012-02-18 09:57:07
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

建议你先用LB培养基试试吧,条件如下,先用3ml培养基挑单菌落培养大概5个小时做种子(37度,250rpm),然后2%的接种量,培养到A600,1.2到1.5之间诱导,诱导时采用25度,250rpm,过夜,如果还是没有目标蛋白,你就要确认你的载体了,如果没有问题,你可能要考虑换下载体了
8楼2012-02-18 11:33:15
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btx362237729

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zhiqiang5070(金币+1): 有帮助 2012-02-20 15:29:25
没有目的条带。。。。你的电泳缓冲液该换新的了  我看感觉都是些杂带
人生最黑暗的时光终于过去了
9楼2012-02-18 18:48:47
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张鹏8902

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

为什么条带不一样直呢?板没清洗干净的样子啊
你若盛开,清风自来
10楼2013-04-11 15:18:25
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