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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家帮忙看看我的蛋白电泳有目的带吗
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] 大家帮忙看看我的蛋白电泳有目的带吗已有1人参与

图中的A1-A6和B1-B6是两个平行组分别诱导1、2、3、4、5、6h，我的蛋白约40kD左右
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无善无恶心之体
1楼2012-02-17 09:50:24
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)
补充：：：： 图中C代表未用IPTG诱导，P为未导入目的基因的空载体/菌诱导表达。我的体系是pET28a/BL21（DH5）。
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无善无恶心之体
2楼2012-02-17 09:53:56
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karin

木虫 (小有名气)
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:49:02
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-17 09:53:56:
补充：：：： 图中C代表未用IPTG诱导，P为未导入目的基因的空载体/菌诱导表达。我的体系是pET28a/BL21（DH5）。

从电泳图看好像没有目的条带。不过pET-28a是带组氨酸标签的，也就是说你表达的蛋白两端都带一段组氨酸，你可以用组氨酸特异抗体做个Western杂交，真正表不表达就知道了。
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坚持就是胜利
3楼2012-02-17 10:17:58
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-17 13:48:45
zhiqiang5070(金币+3): ★有帮助 2012-02-20 15:30:07
按说pET28a的表达产物是单一的，为什么你的图上面有这么多的条带啊？这些条带是培养基里面的蛋白么？建议你用TB培养试试，还有就是不要单纯的用IPTG诱导，适量添加些乳糖。你的样品条带一样的，没有目的条带出现。
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4楼2012-02-17 13:10:20
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by shicaozhu at 2012-02-17 13:10:20:
按说pET28a的表达产物是单一的，为什么你的图上面有这么多的条带啊？这些条带是培养基里面的蛋白么？建议你用TB培养试试，还有就是不要单纯的用IPTG诱导，适量添加些乳糖。你的样品条带一样的，没有目的条带出现。

大肠杆菌自身会表达很多的蛋白的啊
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无善无恶心之体
5楼2012-02-17 14:01:39
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-18 08:14:44
要不就是没有高表达，要不就是你没做好，建议你加一个有高表达的作为阳性对照，诱导3个小时就可以很清楚看到是否高表达，关键是你要控制好诱导条件，在OD多少的时候诱导
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6楼2012-02-17 17:49:35
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shicaozhu

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-17 14:01:39:
大肠杆菌自身会表达很多的蛋白的啊

我用这个质粒做表达的时候，诱导时OD一般为1.0左右，然后加入诱导剂，12，24小时的产物都是单一的，只有36小时后，有比较淡的杂带出现，应该是细胞裂解的碎片。不过我的发酵培养基是TB，你的是什么？
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7楼2012-02-18 09:57:07
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
建议你先用LB培养基试试吧，条件如下，先用3ml培养基挑单菌落培养大概5个小时做种子（37度，250rpm），然后2％的接种量，培养到A600，1.2到1.5之间诱导，诱导时采用25度，250rpm，过夜，如果还是没有目标蛋白，你就要确认你的载体了，如果没有问题，你可能要考虑换下载体了
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8楼2012-02-18 11:33:15
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btx362237729

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhiqiang5070(金币+1): ★有帮助 2012-02-20 15:29:25
没有目的条带。。。。你的电泳缓冲液该换新的了  我看感觉都是些杂带
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人生最黑暗的时光终于过去了
9楼2012-02-18 18:48:47
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张鹏8902

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

为什么条带不一样直呢？板没清洗干净的样子啊
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你若盛开，清风自来
10楼2013-04-11 15:18:25
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