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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)

[求助] 细菌脂肪酶活性的测定

大家好:我想在这跟大家讨论一下脂肪酶活性的测定方法。我是以聚乙烯醇橄榄油乳化液为底物,(2g聚乙烯醇,150ml水,加热溶解,加入50ml橄榄油。用组织搅拌机,匀浆两分钟)粗酶液,用的就是细菌的菌悬液!测定过程:取5ml PH=7.5的磷酸缓冲液5ml,分别到4个锥形瓶中!在40℃预热5min 加入2ml菌悬液,40℃保温15分钟,取出后,加入15ml95%乙醇做终止剂。其中两个空白以失活的酶加入!其他条件都一样!为什么我用0.05mol/L的OHNa滴定,发现消耗的碱量很少,且跟空白差不多!我不知道问题在哪?我的方法哪有不对吗?请各位指教。谢谢!
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只要努力,总会有结果的
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koalarola

新虫 (小有名气)

国标中测脂肪酶活力,空白是不加酶液,楼主可试一试空白不加灭活酶液。如果仍然测定值很低,可能说明酶液失活或者细胞没有完全破碎。
7楼2012-10-30 17:06:55
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-01-08 23:44:51
按你这样说就是酶没反应吧,你用菌悬液,怎么不破碎细胞呢,这个脂肪酶表达不一定是胞外分泌的,采用脂肪酶标准滴定法,应该采用的是粗酶液(细胞破碎液)。还有一种可能就是你的酶活性很低或没活性。
人生百态原为海,看破红尘方为岸!
2楼2012-01-08 22:10:38
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-01-08 22:10:38:
按你这样说就是酶没反应吧,你用菌悬液,怎么不破碎细胞呢,这个脂肪酶表达不一定是胞外分泌的,采用脂肪酶标准滴定法,应该采用的是粗酶液(细胞破碎液)。还有一种可能就是你的酶活性很低或没活性。

您好,如果要破碎细胞,应该怎么做呢?我还想请教一下您,P-NPP法测脂肪酶活性应该怎么做!关键是我的P-NPP不溶,不知如何是好!恳请您的解答!谢谢!
只要努力,总会有结果的
3楼2012-01-08 22:17:52
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


zhang8826857(金币+1): 大力鼓励交流^_^ 2012-01-12 11:07:28
秦川萝卜头(金币+5): 2012-01-12 14:22:40
细胞破碎采用的是超声波破碎仪,要是没有细胞破碎仪的话,你可以采用反复冻融法破碎,后者的效果不是很好。或者采用溶菌酶也行。我们采用pNP系列底物测定酶活,采用紫外分光光度计动力学曲线连续扫描来测定酶促反应斜率。pNP底物采用乙腈溶解,配成10mM浓度就行,然后直接加到反应体系中就可以了。
人生百态原为海,看破红尘方为岸!
4楼2012-01-09 15:54:52
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