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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 细菌脂肪酶活性的测定
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)

[求助] 细菌脂肪酶活性的测定

大家好：我想在这跟大家讨论一下脂肪酶活性的测定方法。我是以聚乙烯醇橄榄油乳化液为底物，（2g聚乙烯醇，150ml水，加热溶解，加入50ml橄榄油。用组织搅拌机，匀浆两分钟）粗酶液，用的就是细菌的菌悬液！测定过程：取5ml PH=7.5的磷酸缓冲液5ml，分别到4个锥形瓶中！在40℃预热5min 加入2ml菌悬液，40℃保温15分钟，取出后，加入15ml95%乙醇做终止剂。其中两个空白以失活的酶加入！其他条件都一样！为什么我用0.05mol/L的OHNa滴定，发现消耗的碱量很少，且跟空白差不多！我不知道问题在哪？我的方法哪有不对吗？请各位指教。谢谢！
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只要努力，总会有结果的
1楼2012-01-07 10:53:30
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koalarola

新虫 (小有名气)
国标中测脂肪酶活力，空白是不加酶液，楼主可试一试空白不加灭活酶液。如果仍然测定值很低，可能说明酶液失活或者细胞没有完全破碎。
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7楼2012-10-30 17:06:55
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-01-08 23:44:51
按你这样说就是酶没反应吧，你用菌悬液，怎么不破碎细胞呢，这个脂肪酶表达不一定是胞外分泌的，采用脂肪酶标准滴定法，应该采用的是粗酶液（细胞破碎液）。还有一种可能就是你的酶活性很低或没活性。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
2楼2012-01-08 22:10:38
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-01-08 22:10:38:
按你这样说就是酶没反应吧，你用菌悬液，怎么不破碎细胞呢，这个脂肪酶表达不一定是胞外分泌的，采用脂肪酶标准滴定法，应该采用的是粗酶液（细胞破碎液）。还有一种可能就是你的酶活性很低或没活性。

您好，如果要破碎细胞，应该怎么做呢？我还想请教一下您，P-NPP法测脂肪酶活性应该怎么做！关键是我的P-NPP不溶，不知如何是好！恳请您的解答！谢谢！
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只要努力，总会有结果的
3楼2012-01-08 22:17:52
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
zhang8826857(金币+1): 大力鼓励交流^_^ 2012-01-12 11:07:28
秦川萝卜头(金币+5): 2012-01-12 14:22:40
细胞破碎采用的是超声波破碎仪，要是没有细胞破碎仪的话，你可以采用反复冻融法破碎，后者的效果不是很好。或者采用溶菌酶也行。我们采用pNP系列底物测定酶活，采用紫外分光光度计动力学曲线连续扫描来测定酶促反应斜率。pNP底物采用乙腈溶解，配成10mM浓度就行，然后直接加到反应体系中就可以了。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
4楼2012-01-09 15:54:52
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