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测酶活前处理心得已有6人参与
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一般一瓶动物细胞长满后用胰酶消化，消化完以后用D-Hinks吹打下来，4℃，1000转，6~10min 离心。倒掉上清，再用D-Hinks重新分散，4℃，1000转，6~10min 离心，倒掉上清（如果暂时不要测酶活的话，直接将离心后的沉淀冻于-80℃，可保存2~3个月，用时直接加生理盐水进行后处理即可）。再用生理盐水重新分散，枪头打匀，超声波破碎，一般一瓶动物细胞加1mL生理盐水，一般用总工作时间300S,，开5S，停10S，槽温度稍设高点，一般50℃（此温度与你EP管内的温度无关，但是温度探针伸到反应体系中的温度就得设低些），20%功率。破碎完后4℃，12000转，5min 离心（看底部的沉淀多少，破碎完全的沉淀应该是很少的，如果还很多，重新打散后加时间再破碎）。将上清取出摇匀后检测蛋白浓度，我用的是考马斯亮蓝+BSA法。然后蛋白用于即时检测，暂时不用的话立刻冻在-80℃，可保存2~3天，但破碎后的蛋白最好当天检测，不然活性会受到影响。 [ Last edited by silicare on 2014-5-14 at 18:30 ] |
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8楼2014-05-14 15:28:15