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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 几丁质酶测酶活的方法
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

[求助] 几丁质酶测酶活的方法 已有1人参与

小弟在测几丁质酶的酶活，是筛选得到的菌株进行摇瓶发酵后测酶活。
发酵培养基只含有几丁质和一些无机矿物离子，发酵三天后测活。
采用DNS法，1mg/ml的葡萄糖做标准曲线。

问题是：1）阳性对照也没有活性
2）分别对发酵液上清、粗酶液、胞内蛋白进行测活，均没有活性

附测活方法：取上清，加入缓冲液，再加入胶体几丁质，然后45度水浴过夜反应，之后终止反应，测活。以灭火的酶液做对照。

希望高手解答！谢谢！
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1楼 2012-09-10 16:18:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦子绿豆: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-11 10:47:39
你确定你发酵之后得到了你要的菌株了 ？做个镜检试试 和你接种的微生物进行对比 看是不是你要的菌株 ，也有可能该微生物没有表达这种酶  ，我们基本都不这么做 如果确定这个微生物产几丁质酶的话 那都是提DNA 测序  然后转大肠杆菌发酵  这种技术比较成熟点
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ControlMyself
2楼2012-09-10 16:48:54
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num20062622

银虫 (正式写手)
楼主 我也要测酶活..
但是不是测几丁质酶
是测纤维素酶活
跟果胶酶活性
也是用DNS法。
但是目前我还不是太会
希望楼主能跟我联系 求交流...
可以么 楼主..
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4楼2012-09-11 17:43:45
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普通回帖

麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2012-09-10 16:48:54
你确定你发酵之后得到了你要的菌株了 ？做个镜检试试 和你接种的微生物进行对比 看是不是你要的菌株 ，也有可能该微生物没有表达这种酶  ，我们基本都不这么做 如果确定这个微生物产几丁质酶的话 那都是提DNA 测序  ...

谢谢！但是目前我是想先测得一株酶活较高的再去测序，鉴定。是测酶活这里卡住了，不过即使你说的方法，最后也是需要测酶活的吧～但我也准备尝试一下，谢谢！
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3楼2012-09-11 10:47:20
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by num20062622 at 2012-09-11 17:43:45
楼主 我也要测酶活..
但是不是测几丁质酶
是测纤维素酶活
跟果胶酶活性
也是用DNS法。
但是目前我还不是太会
希望楼主能跟我联系 求交流...
可以么 楼主..

好的，求交流！短信给你 我的QQ号了
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5楼2012-09-12 09:29:22
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sunnymen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 新虫加油 2012-09-13 15:50:21
现在也在忙着测酶活，正在进行的是蛋白酶。下一批实验准备测几丁质酶。看文献上的都是DNS法，国标也是这样。不过测了蛋白酶之后不太认同国标，如果lz有什么好方法，麻烦告诉我，Thank you !
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6楼2012-09-12 16:57:54
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num20062622

银虫 (正式写手)
楼主 我加你了..
向日葵就是我哈..
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7楼2012-09-12 18:25:44
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sunnymen at 2012-09-12 16:57:54
现在也在忙着测酶活，正在进行的是蛋白酶。下一批实验准备测几丁质酶。看文献上的都是DNS法，国标也是这样。不过测了蛋白酶之后不太认同国标，如果lz有什么好方法，麻烦告诉我，Thank you !

你好！测几丁质酶的国标我没有查到，能给个链接吗？谢谢！关于测活方法的比较可以看一下<氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的测定方法>这篇文章。我认为用DNS法去测几丁质酶活是比较合适的方法。
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8楼2012-09-13 09:21:04
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sunnymen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 麦子绿豆 at 2012-09-13 09:21:04
你好！测几丁质酶的国标我没有查到，能给个链接吗？谢谢！关于测活方法的比较可以看一下<氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的测定方法>这篇文章。我认为用DNS法去测几丁质酶活是比较合适的方法。...

几丁质酶的测定的国标我也没找到，找到的是测纤维素酶、蛋白酶的国标。我想请问lZ，测酶活方法：取上清，加入缓冲液，再加入胶体几丁质，然后45度水浴过夜反应，之后终止反应，测活。以灭火的酶液做对照。这个是你自己设计的，还是有相关文献。
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9楼2012-09-13 14:57:21
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sunnymen at 2012-09-13 14:57:21
几丁质酶的测定的国标我也没找到，找到的是测纤维素酶、蛋白酶的国标。我想请问lZ，测酶活方法：取上清，加入缓冲液，再加入胶体几丁质，然后45度水浴过夜反应，之后终止反应，测活。以灭火的酶液做对照。这个是你 ...

参考的文献，这方面的很多啊
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10楼2012-09-13 18:01:02
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