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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 几丁质酶测酶活的方法
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e101

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主做的是放线菌么？最后你是怎样处理的？镜检是否有待测菌株？45度水浴过夜是否时间太长？
我做的是放线菌，但对照和待测液OD540值几乎一样大小，请问为什么？
大体步骤：
1.打孔菌株摇床发酵（培养液：几丁质胶体2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，无机盐），3-9天；
2.取发酵液1.5ml，5000rpm离心5min,取上清1.0ml加入1.5ml离心管，再加入0.1ml1%胶体几丁质和0.1mPH6.0磷酸缓冲液，45度水浴120min（对照直接沸水浴灭活10min）,然后迅速灭活，15000rpm离心10min；
3.取上清1.0ml加入20ml试管，再加入1.5mlDNS和1.0ml蒸馏水，沸水浴10min,后迅速冷却，补足蒸馏水至8ml，放置20分钟后，测值。
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11楼2012-10-31 15:49:28
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by e101 at 2012-10-31 15:49:28
请问楼主做的是放线菌么？最后你是怎样处理的？镜检是否有待测菌株？45度水浴过夜是否时间太长？
我做的是放线菌，但对照和待测液OD540值几乎一样大小，请问为什么？
大体步骤：
1.打孔菌株摇床发酵（培养液：几 ...

我是只筛选的细菌
45度过夜是为了防止酶活较低测不到数值，后面可以根据实验结果减少反应时间
步骤我大体也是这样操作的，你的意思是空白跟酶液的OD值一样？那结果是能检测到还原糖还是什么？
另外筛选几丁质降解菌的发酵培养基不建议如此丰富，用LB培养基作为种子培养基，以1：10接种量接种后，发酵培养基可选择1/2LB再加入1%胶体几丁质诱导即可
希望能够互相交流！
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12楼2012-10-31 18:50:47
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e101

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 麦子绿豆 at 2012-10-31 18:50:47
我是只筛选的细菌
45度过夜是为了防止酶活较低测不到数值，后面可以根据实验结果减少反应时间
步骤我大体也是这样操作的，你的意思是空白跟酶液的OD值一样？那结果是能检测到还原糖还是什么？
另外筛选几丁质降 ...

谢谢你的耐心回答！
是的，空白跟酶液的OD值几乎一样，OD540值大都在0.02-0.03，检测还原糖。
我做的是放线菌，平时培养用高氏一号培养基，可以用LB作为种子培养基么？发酵培养基可选择1/2LB再加入1%胶体几丁质诱导是设么意思？
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13楼2012-11-01 11:49:22
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by e101 at 2012-11-01 11:49:22
谢谢你的耐心回答！
是的，空白跟酶液的OD值几乎一样，OD540值大都在0.02-0.03，检测还原糖。
我做的是放线菌，平时培养用高氏一号培养基，可以用LB作为种子培养基么？发酵培养基可选择1/2LB再加入1%胶体几丁质诱 ...

因为你筛得的菌株其酶活并不一定很高，适当延长反应时间是有必要的，你可以尝试一下过夜
我不太了解放线菌，不过肯定是用高氏一号培养基啊，LB常用作细菌的培养基，那你可以尝试下发酵培养基用1/2高氏一号(即其中所有成分的含量均为之前的1/2)，再加胶体几丁质至终浓度为1%(w/v)诱导发酵
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14楼2012-11-01 20:27:27
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by e101 at 2012-11-01 11:49:22
谢谢你的耐心回答！
是的，空白跟酶液的OD值几乎一样，OD540值大都在0.02-0.03，检测还原糖。
我做的是放线菌，平时培养用高氏一号培养基，可以用LB作为种子培养基么？发酵培养基可选择1/2LB再加入1%胶体几丁质诱 ...

不知道检测出来没有？
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15楼2012-11-07 10:05:58
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
楼主你好，胶体几丁质的制备方法有很多，请问哪种比较好，最后浓度是怎么确定的？谢谢
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16楼2013-10-22 16:55:06
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 稻草人的学习 at 2013-10-22 16:55:06
楼主你好，胶体几丁质的制备方法有很多，请问哪种比较好，最后浓度是怎么确定的？谢谢

我使用浓磷酸预处理的方法，效果挺好的。
最后浓度你可以取一定体积的胶体几丁质，然后烘干称重。
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17楼2013-10-22 19:37:07
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 麦子绿豆 at 2013-10-22 19:37:07
我使用浓磷酸预处理的方法，效果挺好的。
最后浓度你可以取一定体积的胶体几丁质，然后烘干称重。...

谢谢，以后有问题还来向你请教
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18楼2013-10-23 14:19:01
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well_想太多

新虫 (小有名气)
请问楼主,你在配制胶体几丁质时采用的是浓盐酸溶解还是磷酸溶解,我看有的文献中在配制时没有用的50%的乙醇,不用可以吗?
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19楼2014-02-24 14:31:56
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by well_想太多 at 2014-02-24 14:31:56
请问楼主,你在配制胶体几丁质时采用的是浓盐酸溶解还是磷酸溶解,我看有的文献中在配制时没有用的50%的乙醇,不用可以吗?

85% 浓磷酸 这种方法比用乙醇好一些
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20楼2014-03-01 12:55:39
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