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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 几丁质酶测酶活的方法
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

[求助] 几丁质酶测酶活的方法 已有1人参与

小弟在测几丁质酶的酶活，是筛选得到的菌株进行摇瓶发酵后测酶活。
发酵培养基只含有几丁质和一些无机矿物离子，发酵三天后测活。
采用DNS法，1mg/ml的葡萄糖做标准曲线。

问题是：1）阳性对照也没有活性
2）分别对发酵液上清、粗酶液、胞内蛋白进行测活，均没有活性

附测活方法：取上清，加入缓冲液，再加入胶体几丁质，然后45度水浴过夜反应，之后终止反应，测活。以灭火的酶液做对照。

希望高手解答！谢谢！
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1楼 2012-09-10 16:18:07
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by e101 at 2012-11-01 11:49:22
谢谢你的耐心回答！
是的，空白跟酶液的OD值几乎一样，OD540值大都在0.02-0.03，检测还原糖。
我做的是放线菌，平时培养用高氏一号培养基，可以用LB作为种子培养基么？发酵培养基可选择1/2LB再加入1%胶体几丁质诱 ...

因为你筛得的菌株其酶活并不一定很高，适当延长反应时间是有必要的，你可以尝试一下过夜
我不太了解放线菌，不过肯定是用高氏一号培养基啊，LB常用作细菌的培养基，那你可以尝试下发酵培养基用1/2高氏一号(即其中所有成分的含量均为之前的1/2)，再加胶体几丁质至终浓度为1%(w/v)诱导发酵
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14楼2012-11-01 20:27:27
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦子绿豆: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-11 10:47:39
你确定你发酵之后得到了你要的菌株了 ？做个镜检试试 和你接种的微生物进行对比 看是不是你要的菌株 ，也有可能该微生物没有表达这种酶  ，我们基本都不这么做 如果确定这个微生物产几丁质酶的话 那都是提DNA 测序  然后转大肠杆菌发酵  这种技术比较成熟点
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ControlMyself
2楼2012-09-10 16:48:54
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2012-09-10 16:48:54
你确定你发酵之后得到了你要的菌株了 ？做个镜检试试 和你接种的微生物进行对比 看是不是你要的菌株 ，也有可能该微生物没有表达这种酶  ，我们基本都不这么做 如果确定这个微生物产几丁质酶的话 那都是提DNA 测序  ...

谢谢！但是目前我是想先测得一株酶活较高的再去测序，鉴定。是测酶活这里卡住了，不过即使你说的方法，最后也是需要测酶活的吧～但我也准备尝试一下，谢谢！
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3楼2012-09-11 10:47:20
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num20062622

银虫 (正式写手)
楼主 我也要测酶活..
但是不是测几丁质酶
是测纤维素酶活
跟果胶酶活性
也是用DNS法。
但是目前我还不是太会
希望楼主能跟我联系 求交流...
可以么 楼主..
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4楼2012-09-11 17:43:45
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