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王之御魂

木虫 (小有名气)

[求助] 如何取发酵液测酶活

最近在做米曲霉液体发酵产淀粉酶，测定酶活方法如下：
a)原碘液
称取碘化钾22.0g溶于约300mL水中，加人碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后移入500ml容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(每月制备一次)。
b)稀碘液
称取碘化钾20.0g溶于约300mL水中，准确加入原碘液2.00ml，全部移人500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(须当天配制)。

标准溶液的制备: 取8支试管做好标记,依次加入1g/L可溶性淀粉溶液0mL、0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL, 再用蒸馏水将各试管补至5 mL。得到浓度为0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL 的淀粉标准液。
取8支试管做好标记, 依次加入制作好的淀粉标准液1mL，碘稀释液5mL 混匀, 以1号试管中的溶液作为标准空白样, 在660nm 处测定淀粉标准液的吸光值。
酶活测定：
吸取4mL 可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液1mL，摇匀后于60 ℃恒温水浴中预热5min。立即加入酶液0.2mL, 计时, 摇匀，反应5min。
立即吸取反应液1mL, 加入盛有0.5mL 稀盐酸和5mL 稀碘液的试管中, 摇匀。并以0.5mL稀盐酸和5mL碘稀释液为空白, 在660nm 波长下, 测定吸光值, 制作淀粉含量的标准曲线和回归方程。根据回归方程, 计算反应后溶液中淀粉的浓度。

采用可溶性淀粉做碳源，取发酵液离心（我的米曲霉菌丝体成条状，发酵液澄清，没什么杂质，感觉离不离心区别不大），然后取上清测酶活，问题是淀粉做碳源，发酵液中有淀粉，结果导致实验组吸光值比用水代替发酵液的还要高，颜色还要深（当然我的淀粉酶活肯定也很低），是换一种碳源还是换一种测定方法？用DNS法的话用葡萄糖和麦芽糖做碳源时又怎么办？可是我要做不同碳源的优化实验啊？
       还望高人指点啊？？？？？急急急急啊？？？

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1楼 2012-10-13 22:25:06
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王之御魂: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢指导 2012-10-16 14:05:58
不要紧的，一般可利用的碳源较多的时候，酶活力都较低，到利用得差不多的时候酶活力才高，如果你测定不出酶活力就每天取样测定一次就行，无论什么方法测定都可以的，你会得到底物含量和酶活力变化这两条曲线。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2012-10-13 23:20:52
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王之御魂

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-13 23:20:52
不要紧的，一般可利用的碳源较多的时候，酶活力都较低，到利用得差不多的时候酶活力才高，如果你测定不出酶活力就每天取样测定一次就行，无论什么方法测定都可以的，你会得到底物含量和酶活力变化这两条曲线。

只要发酵液中还有淀粉，就会和稀碘液作用显色，取发酵液测出来的酶活就一定比实际值小啊（我测的酶活基本为零甚至可以说是负值），你的意思是等到培养基中的淀粉被利用完时测得的数值就会是准确的。

底物含量变化曲线怎么得到啊？测酶活时用的底物淀粉是可以定量的，可是加的1ml发酵液里面也有淀粉啊，那里面的淀粉无法定量啊

我上面的测定方法有没有什么问题啊？用0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照对不对啊？还是该用从（4ml水+1ml缓冲液+1ml发酵液）中取1ml+0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照啊？

还望大牛指点详细点啊？我刚刚开始做这个，师兄师姐不是做这个的，身边也没什么人带我
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3楼2012-10-14 09:39:13
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王之御魂

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-13 23:20:52
不要紧的，一般可利用的碳源较多的时候，酶活力都较低，到利用得差不多的时候酶活力才高，如果你测定不出酶活力就每天取样测定一次就行，无论什么方法测定都可以的，你会得到底物含量和酶活力变化这两条曲线。

还有导师要我做的是α-淀粉酶，用DNS法测可以吗？那测得不是总淀粉酶的酶活吗
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4楼2012-10-14 10:32:45
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
用DNS法确实测得到的是总的淀粉酶活力，用碘法才是主要测得到内切酶的活力。

发酵液里残留的淀粉可以将发酵液灭活之后测得。

酶活力测得到是负值确实因为酶活力太低，导致产生误差。
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5楼2012-10-14 14:48:07
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王之御魂

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-14 14:48:07
用DNS法确实测得到的是总的淀粉酶活力，用碘法才是主要测得到内切酶的活力。

发酵液里残留的淀粉可以将发酵液灭活之后测得。

酶活力测得到是负值确实因为酶活力太低，导致产生误差。

其实我不需要测发酵液里残留的淀粉，只想测到真实的α-淀粉酶活，我用碘法测，测OD时对照该如何设置呢？
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6楼2012-10-14 19:22:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
应该用灭活之后的发酵液，而不是水。
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7楼2012-10-14 21:48:48
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王之御魂

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-14 21:48:48
应该用灭活之后的发酵液，而不是水。

可是灭活后的酶液+底物淀粉+缓冲液+0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照，吸光值必定比实验组的大，是不是对照组要水代替底物淀粉液啊
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8楼2012-10-14 23:56:56
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不能这样代替的，你多看看文献。
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9楼2012-10-15 02:59:23
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王之御魂

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-15 02:59:23
不能这样代替的，你多看看文献。

如果取（灭活后的酶液+底物淀粉+缓冲液）1ml+0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照，再把它设为零的话，那实验组的吸光值就是负值了（最大也是零），我看过一些文献，他们直接用0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照的（我用可溶性淀粉做碳源的，这样设不行的），现在真心没折了啊求指点啊
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10楼2012-10-15 09:15:16
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