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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » Help！酶活性突然变低，找不到原因！
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)

[求助] Help！酶活性突然变低，找不到原因！

各位前辈，我的实验是筛菌工作，我好不容易筛到一株蛋白酶活性比较高的细菌，心里很开心。但是在深入研究这株菌的最适pH的时候这株菌出问题了，酶活性突然变得很低很低。又重复做了好几次酶活性实验，还是很低，就在我绝望的时候有一次活性又高起来了。为了排除菌的因素，我把酶活高的发酵液拿来重新涂了平板，长出来单菌落再接种子液和发酵液再测酶活，结果活性又很低很低。我不明白哪里出了问题，都是摇16个小时的种子液，再摇48小时发酵液，药品也一样，菌是我之前筛选得到的，在接种子液之前都划线分离6次以上。但是发酵液离心后菌体沉淀的颜色都不一样，请各位前辈帮我分析分析问题究竟出在哪里呢？
图中沉淀多的是酶活性高的那一次离心得到的，沉淀少的是酶活性低的这一次离心得到的。

发酵液离心



[ Last edited by nancyyazi on 2012-4-20 at 15:23 ]
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1楼2012-04-20 15:17:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sanmiancxh

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-20 18:09:57
nancyyazi: 金币+10 2012-04-20 19:24:04
首先，怀疑不纯，或不稳定。或是发酵过程中染菌了。
其次，假设你已经分纯：
第一，你的检测方法应该没问题吧。
第二，你说菌体沉淀颜色不一样，你确定不是存放的时间长，变了颜色？或者是因为生长量不一样，所以看起来有区别？怀疑：因为培养条件有所变化，比如说，培养基的配制，灭菌温度的不同导致营养成分的变化，pH的不同，通气量的不同等等等等，导致你的菌产酶少。
第三，你可以试试监测不同发酵时间的酶活，看看是不是后期下降了，或是还未达到产酶高峰。
最后，这菌一般不会相我上面说的这么脆弱吧？你是产蛋白酶的菌，你试试不加碳源，只用蛋白胨培养试试。你看酶活高不高。
暂时就想到这些。
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3楼2012-04-20 17:49:36
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上官小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也遇到过这种情况，后来发现是菌变异了，有几次是菌污染导致最后没有酶活性了。
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10楼2012-04-23 11:26:57
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普通回帖

nancyyazi

铜虫 (小有名气)
2楼2012-04-20 16:59:42
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sanmiancxh at 2012-04-20 17:49:36:
首先，怀疑不纯，或不稳定。或是发酵过程中染菌了。
其次，假设你已经分纯：
第一，你的检测方法应该没问题吧。
第二，你说菌体沉淀颜色不一样，你确定不是存放的时间长，变了颜色？或者是因为生长量不一样，所 ...

嗯，你的好多建议我可以试一试，谢谢你
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4楼2012-04-20 19:23:54
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bigboy2050

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是胞外酶吧？生物量不同，酶活应该是不一样的（不知道你的酶活怎么折算的？）；种子液质量会引起发酵液生物量变化。另外，检查下酶活检测试剂。
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职业无分贵贱，做事要有格调
5楼2012-04-21 08:49:05
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bigboy2050 at 2012-04-21 08:49:05:
是胞外酶吧？生物量不同，酶活应该是不一样的（不知道你的酶活怎么折算的？）；种子液质量会引起发酵液生物量变化。另外，检查下酶活检测试剂。

种子液，120rpm，28℃振荡培养16h。以2％的接种量接入发酵培养基中，120rpm，28℃振荡培养48h。发酵液 4℃，10000rpm离心10min，取上清液，采用Folin-酚显色法进行蛋白酶活力的测定。
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6楼2012-04-21 09:18:57
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zhangyt7638

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果说你的种子液配方、发酵液配方及发酵条件在试验中从没变过，那应该是你实验过程中菌出现问题了，可能是退化、变异或染菌不纯了，建议用你的原始菌重新复壮来培养，或者重新再筛一次；菌体量的减少应该还是菌种活力下降的原因，建议调整一下培养基配方，碳氮比很关键，还有就是合适的有机氮源，无机氮源配合使用；你的菌是细菌吧？温度、转速、接种量可以再提高一点，发酵液离心6000 r/min够了
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7楼2012-04-21 16:24:17
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妞妈学习

金虫 (正式写手)
我不懂酶这块。请问，利用酶处理废水中的物质可能吗？废水是制药废水，成分比较复杂，会导致酶变性吗？
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8楼2012-04-23 08:17:29
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aoaoshch

木虫 (小有名气)
接种量用体积计算，不太准。用总菌数吧，把OD值折进来计算。刚开始时先用小瓶把条件都摸清楚再往后做。
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9楼2012-04-23 11:02:06
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