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王之御魂

木虫 (小有名气)

[求助] 如何取发酵液测酶活

最近在做米曲霉液体发酵产淀粉酶，测定酶活方法如下：
a)原碘液
称取碘化钾22.0g溶于约300mL水中，加人碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后移入500ml容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(每月制备一次)。
b)稀碘液
称取碘化钾20.0g溶于约300mL水中，准确加入原碘液2.00ml，全部移人500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(须当天配制)。

标准溶液的制备: 取8支试管做好标记,依次加入1g/L可溶性淀粉溶液0mL、0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL, 再用蒸馏水将各试管补至5 mL。得到浓度为0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL 的淀粉标准液。
取8支试管做好标记, 依次加入制作好的淀粉标准液1mL，碘稀释液5mL 混匀, 以1号试管中的溶液作为标准空白样, 在660nm 处测定淀粉标准液的吸光值。
酶活测定：
吸取4mL 可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液1mL，摇匀后于60 ℃恒温水浴中预热5min。立即加入酶液0.2mL, 计时, 摇匀，反应5min。
立即吸取反应液1mL, 加入盛有0.5mL 稀盐酸和5mL 稀碘液的试管中, 摇匀。并以0.5mL稀盐酸和5mL碘稀释液为空白, 在660nm 波长下, 测定吸光值, 制作淀粉含量的标准曲线和回归方程。根据回归方程, 计算反应后溶液中淀粉的浓度。

采用可溶性淀粉做碳源，取发酵液离心（我的米曲霉菌丝体成条状，发酵液澄清，没什么杂质，感觉离不离心区别不大），然后取上清测酶活，问题是淀粉做碳源，发酵液中有淀粉，结果导致实验组吸光值比用水代替发酵液的还要高，颜色还要深（当然我的淀粉酶活肯定也很低），是换一种碳源还是换一种测定方法？用DNS法的话用葡萄糖和麦芽糖做碳源时又怎么办？可是我要做不同碳源的优化实验啊？
       还望高人指点啊？？？？？急急急急啊？？？

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1楼 2012-10-13 22:25:06
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王之御魂: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢指导 2012-10-16 14:05:58
不要紧的，一般可利用的碳源较多的时候，酶活力都较低，到利用得差不多的时候酶活力才高，如果你测定不出酶活力就每天取样测定一次就行，无论什么方法测定都可以的，你会得到底物含量和酶活力变化这两条曲线。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2012-10-13 23:20:52
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
用DNS法确实测得到的是总的淀粉酶活力，用碘法才是主要测得到内切酶的活力。

发酵液里残留的淀粉可以将发酵液灭活之后测得。

酶活力测得到是负值确实因为酶活力太低，导致产生误差。
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5楼2012-10-14 14:48:07
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
应该用灭活之后的发酵液，而不是水。
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7楼2012-10-14 21:48:48
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不能这样代替的，你多看看文献。
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9楼2012-10-15 02:59:23
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