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@@xiaowu@@

铜虫 (初入文坛)

[求助] 细菌引物 338F 518R 做DGGE之后 pcr 已有1人参与

DGGE 之后 pcr 出来的有两条带 还不清晰 怎么回事呀 请大侠 帮分析一下

12



[ Last edited by @@xiaowu@@ on 2011-12-29 at 20:03 ]
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liuyj863

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857(金币+5): 鼓励新虫,加油 2011-12-30 10:53:48
PCR两条带差的较大,感觉是PCR的问题,理论上说你DGGE上样样品是大小类似的DNA,问题说明有些太简单,不好分析原因,详细说说实验方法步骤,可能有助于解决你的问题。
2楼2011-12-29 21:47:24
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@@xiaowu@@

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by liuyj863 at 2011-12-29 21:47:24:
PCR两条带差的较大,感觉是PCR的问题,理论上说你DGGE上样样品是大小类似的DNA,问题说明有些太简单,不好分析原因,详细说说实验方法步骤,可能有助于解决你的问题。

带GC 的pcr产物挺亮的 DGGE跑完也很好
然后是pcr

10倍buffer 2.5
dntp  2.5
F与R 1
酶  0.25
模板 5
94 1min
60 1min
72 1min
35循环
3楼2011-12-30 09:48:02
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liuyj863

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
rainwander(金币+3): 鼓励交流 2012-01-01 17:35:30
DGGE条带割下来后,是怎么制备PCR模板的,时间放置有多长,根据我的经验,DGGE条带割出来后放置时间长了会出现扩增得不到产物,涂抹带之类的情况。另外,扩增引物也是带了GC夹?是为了再跑一次DGGE,还是...  (我以前割单条DGGE带后无菌水冲洗,置于30ul无菌水中,无菌枪头捣碎,置于4°C 过夜,第二天取1ul液体扩增,效果很好。现在很多年没做过了,详细情况也有些忘记了)
4楼2011-12-30 11:27:39
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uneei

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
zhang8826857(金币+3): 鼓励新虫 2011-12-30 21:18:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuyj863 at 2011-12-30 11:27:39:
DGGE条带割下来后,是怎么制备PCR模板的,时间放置有多长,根据我的经验,DGGE条带割出来后放置时间长了会出现扩增得不到产物,涂抹带之类的情况。另外,扩增引物也是带了GC夹?是为了再跑一次DGGE,还是...  (我 ...

你好,我今天刚刚才做了PCR,昨天切胶,用无菌水洗了两次,加入50微升的无菌水,无菌枪头捣碎,4℃过夜,今天吸取10微升做模板,做60微升体系的PCR,十几个样只有一个扩增效果还可以,其他的不是都二聚体就是只有一点点很淡的条带,这是为什么啊?我的DGGE做的是银染。
5楼2011-12-30 20:20:40
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liuyj863

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-01-01 17:35:47
以前我们一直用这样的方法做,也是银染,只不过用341F-518R扩增,你换个扩增程序试试,特别是退火温度,是否可以降点,或者采用降落PCR策略。
6楼2012-01-01 12:39:39
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白蜓er

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by uneei at 2011-12-30 20:20:40
你好,我今天刚刚才做了PCR,昨天切胶,用无菌水洗了两次,加入50微升的无菌水,无菌枪头捣碎,4℃过夜,今天吸取10微升做模板,做60微升体系的PCR,十几个样只有一个扩增效果还可以,其他的不是都二聚体就是只有一 ...

你好,老师我现在也遇到了你相同的问题,请问你解决了吗?究竟 是什么原因呀?
7楼2015-04-24 19:57:53
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南大微生物

捐助贵宾 (小有名气)


【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 白蜓er at 2015-04-24 19:57:53
你好,老师我现在也遇到了你相同的问题,请问你解决了吗?究竟 是什么原因呀?...

嘿嘿 直接做二代测序好了 嘿嘿
8楼2015-04-24 23:36:14
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白蜓er

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 南大微生物 at 2015-04-24 23:36:14
嘿嘿 直接做二代测序好了 嘿嘿...

那如果我需要DGGE之后TA克隆测序的话,这个怎么搞嘞,请问你有没找到什么原因PCR扩增 不出来呀?
9楼2015-04-25 11:20:56
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 白蜓er at 2015-04-25 11:20:56
那如果我需要DGGE之后TA克隆测序的话,这个怎么搞嘞,请问你有没找到什么原因PCR扩增 不出来呀?...

引物的问题?
10楼2015-06-12 13:13:14
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