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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 细菌引物 338F 518R 做DGGE之后 pcr
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@@xiaowu@@

铜虫 (初入文坛)

[求助] 细菌引物 338F 518R 做DGGE之后 pcr已有1人参与

DGGE 之后 pcr 出来的有两条带 还不清晰 怎么回事呀 请大侠 帮分析一下

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[ Last edited by @@xiaowu@@ on 2011-12-29 at 20:03 ]
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1楼2011-12-29 20:00:04
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liuyj863

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+5): 鼓励新虫，加油 2011-12-30 10:53:48
PCR两条带差的较大，感觉是PCR的问题，理论上说你DGGE上样样品是大小类似的DNA，问题说明有些太简单，不好分析原因，详细说说实验方法步骤，可能有助于解决你的问题。
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2楼2011-12-29 21:47:24
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@@xiaowu@@

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by liuyj863 at 2011-12-29 21:47:24:
PCR两条带差的较大，感觉是PCR的问题，理论上说你DGGE上样样品是大小类似的DNA，问题说明有些太简单，不好分析原因，详细说说实验方法步骤，可能有助于解决你的问题。

带GC 的pcr产物挺亮的 DGGE跑完也很好
然后是pcr

10倍buffer 2.5
dntp  2.5
F与R 1
酶  0.25
模板 5
94 1min
60 1min
72 1min
35循环
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3楼2011-12-30 09:48:02
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liuyj863

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
rainwander(金币+3): 鼓励交流 2012-01-01 17:35:30
DGGE条带割下来后，是怎么制备PCR模板的，时间放置有多长，根据我的经验，DGGE条带割出来后放置时间长了会出现扩增得不到产物，涂抹带之类的情况。另外，扩增引物也是带了GC夹?是为了再跑一次DGGE，还是...  （我以前割单条DGGE带后无菌水冲洗，置于30ul无菌水中，无菌枪头捣碎，置于4°C 过夜，第二天取1ul液体扩增，效果很好。现在很多年没做过了，详细情况也有些忘记了）
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4楼2011-12-30 11:27:39
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uneei

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
zhang8826857(金币+3): 鼓励新虫 2011-12-30 21:18:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuyj863 at 2011-12-30 11:27:39:
DGGE条带割下来后，是怎么制备PCR模板的，时间放置有多长，根据我的经验，DGGE条带割出来后放置时间长了会出现扩增得不到产物，涂抹带之类的情况。另外，扩增引物也是带了GC夹?是为了再跑一次DGGE，还是...  （我 ...

你好，我今天刚刚才做了PCR，昨天切胶，用无菌水洗了两次，加入50微升的无菌水，无菌枪头捣碎，4℃过夜，今天吸取10微升做模板，做60微升体系的PCR，十几个样只有一个扩增效果还可以，其他的不是都二聚体就是只有一点点很淡的条带，这是为什么啊？我的DGGE做的是银染。
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5楼2011-12-30 20:20:40
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liuyj863

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-01-01 17:35:47
以前我们一直用这样的方法做，也是银染，只不过用341F-518R扩增，你换个扩增程序试试，特别是退火温度，是否可以降点，或者采用降落PCR策略。
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6楼2012-01-01 12:39:39
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白蜓er

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by uneei at 2011-12-30 20:20:40
你好，我今天刚刚才做了PCR，昨天切胶，用无菌水洗了两次，加入50微升的无菌水，无菌枪头捣碎，4℃过夜，今天吸取10微升做模板，做60微升体系的PCR，十几个样只有一个扩增效果还可以，其他的不是都二聚体就是只有一 ...

你好，老师我现在也遇到了你相同的问题，请问你解决了吗？究竟 是什么原因呀？
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7楼2015-04-24 19:57:53
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南大微生物

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 白蜓er at 2015-04-24 19:57:53
你好，老师我现在也遇到了你相同的问题，请问你解决了吗？究竟 是什么原因呀？...

嘿嘿 直接做二代测序好了 嘿嘿
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8楼2015-04-24 23:36:14
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白蜓er

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 南大微生物 at 2015-04-24 23:36:14
嘿嘿 直接做二代测序好了 嘿嘿...

那如果我需要DGGE之后TA克隆测序的话，这个怎么搞嘞，请问你有没找到什么原因PCR扩增 不出来呀？
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9楼2015-04-25 11:20:56
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 白蜓er at 2015-04-25 11:20:56
那如果我需要DGGE之后TA克隆测序的话，这个怎么搞嘞，请问你有没找到什么原因PCR扩增 不出来呀？...

引物的问题？
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10楼2015-06-12 13:13:14
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