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新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量扩增曲线与融解曲线分析

刚开始做荧光定量，有关扩增曲线和溶解曲线的问题想要请教高手?扩增曲线如图1：为什么在刚出现平台期后2、3个循环又有上升，这种情况应该怎么改善PCR体系或条件？
溶解曲线如图2：融解温度从55度到95度，55到退火温度87度间不平整的微小峰值是什么意思，这样的曲线能用吗，还是引物仍有问题？

图1 扩增曲线



图2 融解曲线



融解曲线
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1楼 2011-12-26 11:44:22
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新虫 (初入文坛)
有没有高手在线，帮忙分析下？？
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2楼2011-12-26 11:49:22
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yuandian114

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+3): 鼓励积极应助！ 2011-12-26 18:06:38
LZ放心吧，你的定量引物没有任何问题，做出来的图也很漂亮，放到论文上是不会有任何问题的。
从融解曲线来看的话，你得扩增产物是单一的（在主峰之前的亚峰不影响结果），如果LZ还不放心的话建议LZ可以讲扩增产物跑个琼脂糖电泳
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3楼2011-12-26 13:43:20
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zhujiumei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
或许存在蒸发，引物感觉也不是特别好。
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4楼2011-12-26 20:41:06
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妙赞爆米花

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
楼: Originally posted by yuandian114 at 2011-12-26 13:43:20:
LZ放心吧，你的定量引物没有任何问题，做出来的图也很漂亮，放到论文上是不会有任何问题的。
从融解曲线来看的话，你得扩增产物是单一的（在主峰之前的亚峰不影响结果），如果LZ还不放心的话建议LZ可以讲扩增产物 ...

呵呵，谢谢帮忙解答！
还是想请教下，扩增曲线是怎么回事，为什么平台期后又有上升啊，我还需要再怎么改善PCR体系或条件？可以帮忙分析下吗？
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5楼2011-12-26 22:56:05
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新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by zhujiumei at 2011-12-26 20:41:06:
或许存在蒸发，引物感觉也不是特别好。

非常感谢回复，呵呵
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6楼2011-12-26 23:12:14
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haiven

捐助贵宾 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+3): 鼓励交流！GOOD! 2011-12-27 16:17:41
从个人实际经验来讲，你的结果应该是没有问题的，可以放心使用。引物的扩增效率、特异性和模板的量都是合适的，Ct值也在合适的范围。重复性也很好。只是你为什么只做两个重复呢？原则上应该至少是三个重复呢？
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走进你，温暖我，迷失于这个世界！
7楼2011-12-27 08:22:39
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新虫 (初入文坛)
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妙赞爆米花: 回帖置顶 2011-12-27 19:51:00
引用回帖:
楼: Originally posted by haiven at 2011-12-27 08:22:39:
从个人实际经验来讲，你的结果应该是没有问题的，可以放心使用。引物的扩增效率、特异性和模板的量都是合适的，Ct值也在合适的范围。重复性也很好。只是你为什么只做两个重复呢？原则上应该至少是三个重复呢？

呵呵，谢谢回复
是做了3次重复，但有一个样可能是加样的时候出问题了，曲线不太好，我就给剔出去了。
我想请教下，我的扩增曲线属正常吗，为什么平台期后会又有上升呢，能帮忙分析下原因吗？
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8楼2011-12-27 09:19:47
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 感谢应助！ 2011-12-27 16:17:58
有二次扩增，以前有遇过，可能两个方面的原因吧，引物特异性不够，就是可能有错配或者什么的，还有一个原因就是你的体系不行，酶系统不给力，换个别的酶和reaction buffer可能会有改变，根本上还是要改变引物，不然这样的曲线太难看了
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9楼2011-12-27 11:41:51
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可帅儿

银虫 (正式写手)
请问楼主的这两种曲线是同时生成的吗？应该怎么做？
扩增曲线很好看啊~我做出来的都不是很平滑~
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
10楼2012-04-17 15:21:22
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