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hxy2011

金虫 (小有名气)

[交流] 核糖体结合位点与ATG起始密码子的距离问题

我最近目的基因连接一个表达载体，在细菌中表达，ATG起始位点离载体核糖体结合位点20bp左右，会不会影响我的目的基因的表达呢？
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1楼 2011-12-12 21:42:13
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回帖置顶 ( 共有1个 )

longage.gene

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！辛苦啊！ 2011-12-13 18:59:05
引用回帖:
6楼: Originally posted by hxy2011 at 2011-12-13 12:07:38:
其中一个基因RBS附近序列：
ATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGC
                                             SalI         XmaIII
                                          ...

RBS你认为的是哪个？是写有RBS的上方吗？如果是，我认为那2个基因的RBS 99%是错的。
GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCATG目的基因
第一个下划线最像RBS序列，spacer长9~14，spacer虽然有点长，但翻译一般不会有问题；第二个下划线稍微像RBS序列，spacer长2，spacer有点过短，翻译可能很差；总之，这个序列翻译应该不成问题。

GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTATG+目的基因
第一个下划线最像RBS序列，spacer长22~27，spacer有点长，翻译效率会下降较多；第二个下划线稍微像RBS序列，spacer长约15，spacer有点长，因为RBS序列也不太好，翻译可能很差；第三个下划线比较像RBS序列，但spacer有点过短，翻译可能不太好；总之，这个序列翻译效率可能比上面那个基因差甚至检测不到。

排除promoter因素，从RBS看，第一个应该问题不大，第二个有点困难。这些是推测，还得看你实际实验结果，毕竟微生物的种间差异很大，不能妄下定论。结果出来后望告知。
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7楼2011-12-13 16:04:47
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panda73

金虫 (小有名气)
★ ★
hxy2011(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-12-13 18:58:21
一般RBS距ATG的距离在3-10个碱基，你的什么载体，会呈现这种情况？
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2楼2011-12-12 21:54:13
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-12 21:54:13:
一般RBS距ATG的距离在3-10个碱基，你的什么载体，会呈现这种情况？

我们实验室自己构建的一个载体，那么怎么解决这个问题呢，是不是自己在设计引物是要自己加上啊
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3楼2011-12-12 22:34:06
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longage.gene

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
hxy2011(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): Good！ 2011-12-13 18:58:37
你贴上你的atg开始上游30个左右碱基序列，我帮你看看。一般来说spacer过长翻译变弱，但不一定，看过有的论文报道长到40以上效果更好，但那是特例。你认为你的spacer有20多，有些同学不会看rbs，也有可能在atg上游有类似rbs序列也能用。
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胡武佳
4楼2011-12-13 07:40:07
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by longage.gene at 2011-12-13 07:40:07:
你贴上你的atg开始上游30个左右碱基序列，我帮你看看。一般来说spacer过长翻译变弱，但不一定，看过有的论文报道长到40以上效果更好，但那是特例。你认为你的spacer有20多，有些同学不会看rbs，也有可能在atg上游 ...

我把我两个基因的载体位置给你，帮我看下吧。谢谢！
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5楼2011-12-13 11:05:04
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by longage.gene at 2011-12-13 07:40:07:
你贴上你的atg开始上游30个左右碱基序列，我帮你看看。一般来说spacer过长翻译变弱，但不一定，看过有的论文报道长到40以上效果更好，但那是特例。你认为你的spacer有20多，有些同学不会看rbs，也有可能在atg上游 ...

其中一个基因RBS附近序列：
ATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGC
                                             SalI         XmaIII
                                          SstI            NotI
                                          SacI            Eco52I
                                        Ecl136II          EagI
                                EcoRI   EcoICRI   
GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCATG目的基因
                     RBS

另一个基因RBS附近序列：
ATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGC
                                             SalI         XmaIII
                                          SstI            NotI
                                          SacI            Eco52I
                                        Ecl136II          EagI
                                EcoRI   EcoICRI    HindIII        XhoI
GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTATG+目的基因
                    RBS
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6楼2011-12-13 11:07:38
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hxy2011

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by longage.gene at 2011-12-13 16:04:47:
RBS你认为的是哪个？是写有RBS的上方吗？如果是，我认为那2个基因的RBS 99%是错的。
GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCATG目的基因
第一个下划线最像RBS序列，spacer长9~14，spacer虽然有点 ...

非常感谢。原始质粒的RBS就是AGGAA，我在复制序列的时候出现了问题。第二个基因是里RBS比较远的酶切位点连接的。那像这种情况怎么解决呢？是不是要在设计引物时自己加RBS？
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8楼2011-12-13 18:21:18
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longage.gene

银虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): Good! 2011-12-14 14:34:36
引用回帖:
8楼: Originally posted by hxy2011 at 2011-12-13 19:21:18:
非常感谢。原始质粒的RBS就是AGGAA，我在复制序列的时候出现了问题。第二个基因是里RBS比较远的酶切位点连接的。那像这种情况怎么解决呢？是不是要在设计引物时自己加RBS？

总之一个原则，atg前要RBS，spacer 5~10为佳，远些问题不大，短了问题很大。至于什么方法加RBS，具体问题具体分析，因为有很多方法。 你的第一个基因RBS要再近点效率会提升不少。
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9楼2011-12-13 22:12:57
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小小亚杰

木虫 (正式写手)
★
hxy2011(金币+1):谢谢参与
过来学习啦
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10楼2011-12-14 22:02:31
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胡武佳

新虫 (小有名气)
★
hxy2011(金币+1): 谢谢参与
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by longage.gene at 2011-12-13 07:40:07
你贴上你的atg开始上游30个左右碱基序列，我帮你看看。一般来说spacer过长翻译变弱，但不一定，看过有的论文报道长到40以上效果更好，但那是特例。你认为你的spacer有20多，有些同学不会看rbs，也有可能在atg上游有 ...

RBS怎么看啊
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11楼2018-08-08 19:36:51
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