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月之光羽

木虫 (小有名气)

[交流] RT-PCR扩增图和溶解曲线跑成这样

各位虫友，
       最近做RT-PCR，扩增图和溶解曲线跑成这样，我的退火温度为57度，不知道怎么回事，同样的条件，其它的做的挺好的，就是这几个样是这样，求帮忙！

扩增



溶解曲线
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1楼 2011-11-20 20:20:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

月之光羽

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wuyucool at 2011-11-20 21:46:05:
看一下转录组数据，这几个基因表达的情况如何？ 引物做PCR结果如何？

我做了6个模板，同时做了6个基因，其中第2个模板的都是这种情况，并且都没有给出CT值，还有两个模板的3个基因也是这种情况，另外的都很好，剩下3个模板的6个基因都很好，所以引物估计没问题，是退火温度还是其它？图中是数据，undet.是没有CT的意思吧？
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5楼2011-11-20 22:35:28
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普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
月之光羽(金币+1):谢谢参与
如果模板都一样的话，机子没问题，应该是引物的事情。
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2楼2011-11-20 21:33:50
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wuyucool

铁杆木虫 (著名写手)
★
月之光羽(金币+1):谢谢参与
看一下转录组数据，这几个基因表达的情况如何？ 引物做PCR结果如何？
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3楼2011-11-20 21:46:05
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月之光羽

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-20 21:33:50:
如果模板都一样的话，机子没问题，应该是引物的事情。

我做了6个模板，同时做了6个基因，其中第2个模板的都是这种情况，并且都没有给出CT值，还有两个模板的3个基因也是这种情况，另外的都很好，剩下3个模板的6个基因都很好，所以引物估计没问题，是退火温度还是其它？
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4楼2011-11-20 21:56:59
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xiaomage9527

金虫 (正式写手)
★
月之光羽(金币+1):谢谢参与
上图的荧光曲线碰到过    那是用ABI 7500fast仪器， Fermentas的SYBR Green做的，重复了几次都是那样（最开始有过一次正常的，仅一次而已），后来换了ABI的SYBR做，再没出现这种情况，（要么是正常有检测到，要么是CT值靠后，要么没检测信号，这些都是正常的结果），我觉得很可能是所用试剂（SYBR Green MIX）的问题
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6楼2011-11-22 10:32:38
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高天上圣

银虫 (正式写手)
★
月之光羽(金币+1):谢谢参与
这几个基因的丰度是不是太低？
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7楼2011-11-30 21:36:22
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晓风残月cl

新虫 (正式写手)
★
月之光羽(金币+1): 谢谢参与
你还是先用普通PCR扩试一下  看看能否扩的出来   退火是否合适  有没有二聚体
这样盲目的做  荧光试剂很贵的
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8楼2012-04-26 15:22:33
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
★
月之光羽(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
7楼: Originally posted by 高天上圣 at 2011-11-30 21:36:22
这几个基因的丰度是不是太低？

好像丰度低跑出来的溶解曲线确实很难看。
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9楼2013-01-16 10:26:52
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cnb1987

银虫 (小有名气)
★
月之光羽(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
5楼: Originally posted by 月之光羽 at 2011-11-20 22:35:28
我做了6个模板，同时做了6个基因，其中第2个模板的都是这种情况，并且都没有给出CT值，还有两个模板的3个基因也是这种情况，另外的都很好，剩下3个模板的6个基因都很好，所以引物估计没问题，是退火温度还是其它？ ...

你好，我问一下，荧光定量，最后一组数据，Tm,应该在81-89之间吧？你知道为什么么？
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10楼2013-01-16 11:02:05
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高天上圣

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yangjianchen at 2013-01-16 10:26:52
好像丰度低跑出来的溶解曲线确实很难看。...

丰度低最好用TaqMan法
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11楼2013-01-16 15:14:32
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猴子请救兵？

木虫 (著名写手)
★
月之光羽(金币+1): 谢谢参与
以我做pcr失败的经验来说，我觉得是底物模板太少了。
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12楼2015-06-22 09:02:27
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哎呀那个雨

铜虫 (初入文坛)
★
月之光羽(金币+1): 谢谢参与
我也跑出来过这种曲线，模板量不够
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13楼2015-07-29 11:07:23
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