应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了
261/3返回列表123下一页
查看: 8105  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

illcf_11

银虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌基因重组时PKD46高温怎么都消除不了

小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下：
1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：1000转接至新鲜培养基，培养至OD600=0.2时加入，阿拉伯糖至终浓度100mM,继续培养到OD0.6时，制备电转感受态细胞。
2、将打靶分子（pkd3来源，氯霉素抗性）200ng左右，1800V,4.1至4.3ms电转至感受态中，37度培养2h后，涂布于氯霉素抗性的LB平板，37度过夜培养。
3、将氯霉素平板上长出的克隆，再次在氯霉素板上划线，并PCR验证基因组是否敲除。阳性结果再制备化转感受态，准备将pcp20转进去，将氯霉素抗性消除。可是次日 平板上的克隆数巨多。
推测是在制备感受态的时候之前的pkd46没有消除。于是将具有氯霉素抗性的单克隆接种至摇瓶，提高培养温度至42甚至45度，企图消除内涵的pkd46，转接数次，划线amp平板，均生长状态良好。如今我无法消除pkd46，严重影响后面转化pcp20后，阳性克隆的挑选率。
哪位高手能指教一下……到底哪里出错，或是可以怎么解决
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-10-27 10:47:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

602059625

金虫 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lloveyr at 2011-10-28 15:05:51:
这几个质粒我以前用过，好像没有楼主说的问题啊。在消除质粒时 ，培养液中不能加抗生素，然后在无抗性平板上划线，然后验证对单菌落进行氨苄敏感氯霉素抗性筛选（可以用传统的牙签点种法），同时要注意菌不要过多 ...

“同时要注意菌不要过多的接触氯霉素，否则会出现即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况。”
氯霉素基因已经消除怎么还会有氯霉素抗性呢
赞一下(1人) 回复此楼
[url=http://ip.WoTuLa.com][img]http://i.WoTuLa.com/note.png?name=填写姓名&say=这里填写您想说的内容。[/img][/url]
7楼2011-10-28 21:53:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gandalf886

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by illcf_11 at 2011-10-27 10:47:54:
小妹这些时间在做red基因重组技术，遇到pkd46质粒在高温下（42度甚至45度）还无法消除。具体步骤如下：
1、将PKD46化转到W3110中，挑取单克隆，提取质粒，初步验证后，接种至AMP培养基中30度过夜培养，次日1：10 ...

42度液体多转接几代（不加抗生素），稀释后涂无抗平板，42度培养，然后无抗平板传代，同时划线amp平板，肯定能消掉的
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2011-11-25 17:36:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tianhome

木虫 (知名作家)
引用回帖:
23楼: Originally posted by sparkledyd at 2018-10-29 20:24:22
您好!我现在遇到得问题也是pkD46消不掉，传了14代  高温45度传的 ，仍然消不掉！请问关于低磷培养基可以详细说下嘛...

就是在磷酸盐不足的培养基中传代，五年了，你还记得我，谢谢！
赞一下(1人) 回复此楼
虫洞
24楼2018-10-29 21:05:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

illcf_11

银虫 (初入文坛)
没人知道么？
回复此楼
2楼2011-10-27 12:32:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)
我也有遇到类似的问题，有高人能给指点一下吗？
赞一下 回复此楼
3楼2011-10-27 13:46:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
点确定回帖应助！
赞一下 回复此楼
真相是最大的奢侈品
4楼2011-10-27 16:13:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lloveyr

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

illcf_11(金币+10): 谢谢，目前已经解决了，是我们的PKD46温敏出了问题，换了新的质粒就好了 2011-11-24 08:41:55
这几个质粒我以前用过，好像没有楼主说的问题啊。在消除质粒时 ，培养液中不能加抗生素，然后在无抗性平板上划线，然后验证对单菌落进行氨苄敏感氯霉素抗性筛选（可以用传统的牙签点种法），同时要注意菌不要过多的接触氯霉素，否则会出现即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况。
赞一下 回复此楼
5楼2011-10-28 15:05:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

602059625

金虫 (知名作家)
“阳性结果再制备化转感受态，准备将pcp20转进去，将氯霉素抗性消除。可是次日 平板上的克隆数巨多。”
pcp20转进去之后涂什么抗生素的平板？
这是想筛已经转进pcp20的菌吗
pcp20上有amp、kan、cm三种抗性基因，如果担心pKD46还没有消除，可以涂cm平板来筛已经转进pcp20的菌
消除基因组上的cm时应该是在无抗生素的LB中培养吧
--------------------------------------------------------------------------------------------
其实我也是做了几次还没成功
赞一下 回复此楼
[url=http://ip.WoTuLa.com][img]http://i.WoTuLa.com/note.png?name=填写姓名&say=这里填写您想说的内容。[/img][/url]
6楼2011-10-28 21:51:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lloveyr

金虫 (正式写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): good!鼓励交流! 2011-11-15 17:35:07
引用回帖:
7楼: Originally posted by 602059625 at 2011-10-28 21:53:57:
“同时要注意菌不要过多的接触氯霉素，否则会出现即使氯霉素基因已经消除菌仍有氯霉素抗性的情况。”
氯霉素基因已经消除怎么还会有氯霉素抗性呢

菌会自发产生抗性，一直用氯霉素挑选，会有可能将这种自发产生的抗性强化。我以前做这个实验时遇到过这种问题，给个建议而已
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-10-29 17:45:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fanny_21

银虫 (小有名气)
楼主，我也在做W3110的基因敲除，请教一下为什么我的线性片段电转化后总是得不到阳性克隆呢？
赞一下 回复此楼
9楼2011-11-03 14:20:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huiee

金虫 (正式写手)
我想问一下 PKD46 是啥质粒 是温度敏感性origin的质粒吗
还有PCP20是啥质粒 怎么消除氯霉素
赞一下 回复此楼
10楼2011-11-15 02:07:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 illcf_11 的主题更新
261/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[职场人生] 40+中年人失业后，还能找到好工作吗？ +9 xqy2009 2026-10-13 11/550 2026-10-15 16:37 by beefly
[有机交流] 用NBS溴化时溶剂除了CCl4外还有什么 +3 18834002860 2026-10-12 6/300 2026-10-15 14:30 by 长沙摩尔信息科�
[基金申请] 申请科研项目纯靠实力能成功吗？ 200+7 David1982 2026-10-13 11/550 2026-10-15 10:30 by zyqchem
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +11 Isak0320 2026-10-12 15/750 2026-10-14 21:55 by 猫鱼不是鱼
[论文投稿] 二审4个多月了还是Awaiting Reviewer Scores 10+3 纳斯达克ML 2026-10-11 4/200 2026-10-14 17:30 by babero
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +8 wangyl_123 2026-10-10 13/650 2026-10-14 15:12 by zuesli
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +4 好运来～9527 2026-10-10 7/350 2026-10-13 08:41 by xli1984
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭